动物脑、周围神经干及骨骼肌内乙酰胆碱酯酶在死后不同时间的降解比较

杨胜波 张 永 张仕斌 刘茂生 蒋彦军 李寿田 唐 谦

1(遵义医学院人体解剖学教研室,遵义563000)

2(遵义医学院实验动物中心,遵义563000)

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)在胆碱能神经细胞体合成,经轴浆流快速运输到达骨骼肌,分解乙酰胆碱,调节骨骼肌的舒缩。有人曾对尸僵不同时期肌肉的形态改变和磷酸化酶的改变作过研究[1,2],也有人对鼠不同温度条件下骨骼肌内AChE、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和钙激活三磷腺苷酶的变化做了对比研究,建议检测AChE作为法医学指标[3]。本文拟在同一温度条件下,对不同动物,不同组织内的AChE作比较,以证实其作为法医学检测证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与取材

成年家兔、SD大鼠和犬各30只,随机分为5组,每组6只。分别为0、3、6、12、24 h组。空气栓塞与颈部脱臼处死动物,置于实验室内。分别于0、3、6、12、24 h进行取材,取各动物大脑额叶皮质0.5×0.5 cm;腘窝处坐骨神经干0.5～1 cm;腓肠肌中部0.5 ×0.5 m大小的组织块。实验都在冬春季节进行的。控制室温在14℃～20℃,避免温度的影响。

1.2 Karnovsky-Roots乙酰胆碱酯酶组织化学法

将标本置于10%中性甲醛,4℃冰箱内固定1小时,PBS反复冲洗,OCT包埋,冰冻切片10μm厚,每个组织块取20张切片。白胶玻片上自然凉干,4℃Karnovsky-Roo ts孵育液中孵育24h,双蒸水冲洗,甘油明胶封片。Leica图像分析仪上对每张切片随机抽的5个视野进行灰度值测量。每份孵育液:碘化乙酰硫代胆碱12.5mg,双蒸水2 m l,0.1 M磷酸氢二钠9 m l,0.1 M磷酸二氢钠7 m l,30 mM硫酸铜2.5 m l,5 mM铁氰化钾2.5 m l,0.1 M柠檬酸钠1 m l。孵育液孵育前20分钟配制而成。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同种动物大脑皮质AChE死后不同时间的降解比较

如表1显示,家兔、SD大鼠和犬大脑皮质AChE灰度值从死后0h至24h的递增范围分别是186.74～248.55;183.58～247.36;185.28～246.01。其活性分别降低了33.09%;34.74%;32.77%。对不同动物死后同一时间点上的灰度值作 q检验,P> 0.05,而同种动物和不同种动物死后的不同时间之间作t检验,P<0.05。

2.2 不同种动物坐骨神经干内AChE在死后不同时间的降解比较

从表2得知,家兔、SD大鼠和犬坐骨神经干内AChE灰度值从死后0h至24h的递增范围分别是180.23～244.29;179.44～246.26;181.58～247.91。其活性分别降低了35.54%;37.23%;36.52%。对不同动物死后同一时间点上的灰度值作q检验,P> 0.05,而同种动物和不同种动物死后的不同时间之间作t检验,P<0.05。

2.3 不同种动物腓肠肌内AChE死后不同时间的降解比较

如表3显示,家兔、SD大鼠和犬腓肠肌内AChE灰度值从死后0h至24h的递增范围分别是176.39～237.47;173.51～238.05;173.77～232.61。其活性分别降低了34.62%;37.19%;33.86%。对不同动物死后同一时间点上的灰度值作 q检验,P> 0.05,而同种动物和不同种动物死后的不同时间之间作t检验,P<0.01。

2.4 动物死后三种组织内AChE降解的比较

三种组织内死后同一时间的AChE比较,总是大脑皮质灰度值最大,坐骨神经干内次之,腓肠肌内值最小。三种组织内的AChE灰度值在死后同一时间与不同时间的q检验,p<0.01,不同种动物同一组织内AChE在死后同一时间上的比较,P>0.05(见表1～3)。

表1 不同动物大脑皮质AChE在死后不同时间的降解变化(灰度值,±s)Tab.1 Degradative changes of AChE of cortex in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

表1 不同动物大脑皮质AChE在死后不同时间的降解变化(灰度值,±s)Tab.1 Degradative changes of AChE of cortex in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

0h 3h 6h 12h 24h家兔 186.74±11.30 214.01±11.43 224.98±18.06 231.03±21.30 248.55±18.65 SD大鼠 183.58±15.36 215.44±17.01 225.44±19.56 236.55±22.06 247.36±17.16犬185.28±14.33 215.65±16.13 221.73±17.98 233.46±22.69 246.01±14.91

表2 不同动物坐骨神经干内AChE在死后不同时间的降解变化(±s)Tab.2 Degradative changes of AChE of sciatic nerve trunk in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

表2 不同动物坐骨神经干内AChE在死后不同时间的降解变化(±s)Tab.2 Degradative changes of AChE of sciatic nerve trunk in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

0h 3h 6h 12h 24h家兔 180.23±19.87 210.00±11.03 224.08±10.60 234.18±16.35 244.29±11.06 SD大鼠 179.44±16.35 213.68±14.65 226.40±11.73 237.23±15.19 246.26±13.51犬181.58±17.88 210.45±12.38 229.04±12.49 231.77±16.22 247.91±11.80

表3 不同动物腓肠肌内AChE在死后不同时间的降解变化(灰度值,±s)Tab.3 Degradative changes of AChE of grastromem ius in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

表3 不同动物腓肠肌内AChE在死后不同时间的降解变化(灰度值,±s)Tab.3 Degradative changes of AChE of grastromem ius in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

死后0h 死后3h 死后6h 死后12h 死后24h家兔 176.39±10.87 189.57±10.95 191.31±13.09 224.02±14.68 237.47±11.53 SD大鼠 173.51±11.02 188.58±11.32 194.38±11.81 225.46±10.85 238.05±12.04犬173.77±13.37 187.98±10.78 196.78±12.21 226.54±13.35 232.61±11.73

3 讨论

AChE在运动神经元胞体合成,经轴浆运输到达突触间隙,是胆碱能活性的重要标记[4]。正常生理情况下,神经末端释放的乙酰胆碱结合到运动终板处烟碱型乙酰胆碱受体的α1亚基上,并使肌细胞膜在突触部位去极化,该局部的去极化导致附近电压门控钠通道的活化,使动作电位沿肌纤维表面放大和扩散,引起肌肉收缩,继而AChE水解乙酰胆碱,终止神经传递,肌肉松弛。为了在时空里能严格控制胆碱能神经兴奋的传递,AChE在突触间隙的积聚,是一个必要条件。AChE在突触间隙是稳定的,突触外周是可动的[5]。而AChE在突触基底膜的积聚依赖于三元络合物(胶原Q、基底膜蛋白多糖、肌肉特殊激酶)的介导与绑定[6]。

目前所用的酶组织化学染色在观察结果时常采用半定量方法,有一定缺陷。而灰度是指黑白图像中点的颜色深度,范围一般从0到255,白色为255,黑色为0,即组织染色越深,灰度值越小。本实验结果中如果灰度值越小,则乙酰胆碱酯酶活性越强,降解越少。酶组织化学染色,常由于实验条件不一致,染色的强度则发生差异,为了避免该方法的这一缺点,采用不同时间组的动物组织在同一条件下(温度、切片厚度、孵育液PH值和孵育时间等)进行,排除人为干扰,有机结合图像分析,结果较可靠,在判断死亡时间上则更具有价值。本实验未作脊髓前角内运动细胞体AChE的降解检测,出于取材方便的考虑,取了大脑皮质。

不同动物和不同组织内AChE的灰度值从死后0 h至24 h逐渐递增,即死后酶降减逐渐加重。同种动物三种组织内死后同一时间的AChE比较,总是大脑皮质灰度值最大,坐骨神经干内次之,腓肠肌内值最小。这是因为AChE在神经细胞体合成,经过轴突运输达到运动终板的。因突触间隙的特殊位置以及AChE自身的耐活性质,腓肠肌内出现反应最明确,稳定性最高,降解最缓慢。三种组织内的ACh E灰度值在死后同一时间与不同时间的比较,P <0.01,不同种动物同一组织在同一时间上的比较 P >0.05,无统计学差异,因此,可用它来作为法医学推断人死亡时间的检测指标。

[1] Sanes JR,Lichtman JW.Development of the vertebrate neuromuscular junction[J].Annu Rev Neurosci,1999,22:389-442.

[2] Burden SJ.The formation of neuromuscular synapses[J]. Genes Dev,1998,12(2):48-133.

[3] Jun WH,Bing L,Yan Z,et al.A study on the degradative changes of acetylcholin esterase(AChE)of the skeletal muscle motor end-plate at various postmortem intervals——a quantitive enzyme histochemical analysis[J].Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2000,9(4):474-479.

[4] Wu P,Tarasenko Y,Gu Y,et al.Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat[J].Nat Neurosc 2002,5(12):1271-1276.

[5] Martinez-Penay Valenzuela I,Akaaboune M.Acetylcholinesterase Mobility and Stability at the Neuromuscular Junction of Living Mice[J].Molecular Biology of the Cell,2007,18(8):2904-2911.

[6] Annie C,Laure S,Manuel G,et al.M uSK is required for anchoring acetylcholinesterase at the neuromuscular junction[J]. The Journal of Cell Biology,2004,165,(4):505-551.