不同潮气量机械通气对大鼠肺组织HMGB1表达的影响

任艳军，张新日

（1.山西医科大学，太原 030001；2.山西医科大学第一临床医学院呼吸内科，太原 030001）

机械通气具有两面性，使用不当会产生严重的并发症——呼吸机相关性肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）。据最新统计，VILI的发生率在机械通气患者中高达15％，其发生机制非常复杂，涉及面非常广泛［1］。本实验试图通过测定不同潮气量机械通气大鼠肺组织HMGB1mRNA及其蛋白的表达水平，探讨HMGB1与VILI之间的关系，从而为VILI的基础研究和临床防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组及模型制备

雄性健康W istar大鼠24只（山西医科大学实验动物中心提供，合格证号：山医字第070101），体重310～380 g，随机分为3组：①对照组：未行机械通气；②小潮气量组：VT=7 m L/kg；③大潮气量组： VT=30 m L/kg。

25％乌拉坦（4 m L/kg）腹腔注射麻醉大鼠后行气管切开。除对照组外，其余各组大鼠均通过胶管与动物人工呼吸机（DH-150型，浙江大学医学仪器厂制造）相连接，行机械通气。各组大鼠的通气参数除潮气量外，其余均相同，即 I∶E=1∶3，FiO2= 21％，F=60次/min，通气时间为150 min。

通气结束后切断腹主动脉放血处死大鼠，切取肺脏，左肺用中性甲醛液灌注固定，常规石蜡包埋用于普通病理、免疫组化和原位分子杂交检测。右肺行支气管肺泡灌洗术（2 m L×4次），留取支气管肺泡灌洗液（BALF）。BALF回收量不少于80％，以3 000 r/min离心 10 min，取上清液 -30℃冻存待测。

1.2 大鼠肺组织HE染色

采用伊红-苏木素染色法在光镜下观察肺组织和各级支气管的损伤情况。

1.3 大鼠 BALF中髓过氧化物酶（M PO）活性测定

采用髓过氧化物酶检测试剂盒测定 BALF中MPO活性。测定方法及操作步骤按试剂盒说明进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 肺组织HMGB1免疫组织化学染色

采用链霉素亲和-生物素-过氧化酶复合物（SABC）法对肺组织细支气管上皮细胞进行HMGB1免疫组织化学染色，具体操作步骤参照试剂盒说明（试剂盒购自北京博奥森生物有限公司）。兔抗大鼠抗体工作浓度为1∶50，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。结果判断：阳性染色为细胞胞浆和胞核内出现棕黄色颗粒。在400倍光镜下对每张组织切片随机选取5个高倍视野或直径100～200μm的细支气管进行观察。采用 BI-2000医学图像分析系统分别检测每个视野HMGB1阳性细胞的平均光密度值（A），以上述5个视野的平均值作为该大鼠细支气管上皮细胞HMGB1蛋白表达的相对含量。

1.5 肺组织HMGB1m RNA原位杂交检测

采用原位分子杂交技术检测肺组织 HMGB1 mRNA表达，具体操作步骤按试剂盒（购自武汉博士德生物有限公司）说明进行。阳性染色为细胞胞浆呈棕黄色，检测结果分析判断方法同上。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 肺组织HE染色

HE染色光镜下观察，对照组肺泡结构和各级支气管上皮完整，肺间质无炎症细胞浸润。小潮气量仅见少量炎症细胞浸润，但肺间质无明显水肿。大潮气量组可见弥漫性肺间质水肿和炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚，部分肺泡破裂融合，小血管断裂，肺泡腔内有出血（图1～2）。

2.2 大鼠BALF中M PO活性测定结果

各组大鼠BALF中MPO活性测定结果见表1。结果显示：与对照组和小潮气量组比较，大潮气量组大鼠BALF中MPO活性明显增高（均P＜0.01），对照组与小潮气量组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

MPO活性用酶活力单位表示，即每克组织蛋白在37℃的反应体系中使H2O2分解为1μm为一个活力单位。

2.3 肺组织支气管上皮细胞HMGB1免疫组织化学染色结果

各组大鼠肺组织支气管上皮细胞HMGB1免疫组织化学染色结果见表1和图3～5。结果显示，与对照组和小潮气量组比较，大潮气量组肺组织支气管上皮细胞HMGB1表达明显增多（均P＜0.01），对照组与小潮气量组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠肺组织HMGB1 mRNA，蛋白的表达及BALF中MPO活性（±s）Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

表1 各组大鼠肺组织HMGB1 mRNA，蛋白的表达及BALF中MPO活性（±s）Tab.1 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the lung and MPO in BALF in different groups

注：与对照组比较：*P＜0.01；与小潮气量组比较：#P＜0.01Note：*P ＜0.01，compared with the controe group；#P ＜0.01，compared with the low tidal volume group.

组别Group 例数n HMGB1 mRNA表达 HMGB1蛋白表达 BALF中MPO活性（U/L）对照组8 6.94±0.44 6.40±0.47 22.20±5.31小潮气量组 8 7.27±0.43 6.94±0.57 23.21±6.32大潮气量组 8 15.70±1.50*# 12.9±0.80*# 51.20±6.01*#

2.4 肺组织支气管上皮细胞HMGB1 m RNA原位杂交检测

各组大鼠肺组织HMGB1 mRNA原位分子杂交测定结果见表1和图6～8（图1～8见彩插3）。结果显示，大潮气量组大鼠肺组织支气管上皮细胞HMGB1 mRNA表达明显高于对照组和小潮气量组（均P＜0.01），对照组与小潮气量组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

大量研究表明，炎症细胞和细胞因子在VILI发病过程中具有重要作用。肺泡上皮受到机械牵拉后可释放多种炎症细胞因子，如MIP-1α、TNF-α、LI-1β、LI-6及LI-8等，使中性粒细胞和巨噬细胞在肺内大量募集活化。中性粒细胞和和巨噬细胞活化后不但产生大量弹力酶和胶原酶，还可释放大量过氧化物。这些物质可直接或间接破坏肺泡上皮和血管内皮细胞，引起肺组织损伤［2］。本研究也证实了这点，病理可见大潮气量通气组大鼠肺组织弥漫性肺间质水肿和炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚。Brad ley等［3］研究表明，MPO水平与中性粒细胞数之间存在极显著的相关性，可作为中性粒细胞的活性标志。本研究显示，大潮气量组BALF中MPO活性明显高于小潮气量和正常组，表明中性粒细胞在肺内募集，活化在VLIL中起着重要作用，同时也说明VLIL中确实存在炎症反应。

高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种重要的炎症因子，因其在聚丙酰胺凝胶电泳中具有高迁移率而得名。HMGB1的生物学活性极为丰富，不但参与细胞的分化、迁移和再生，还可介导机体的炎症反应［4-5］。Wang等［6］研究发现给予受试小鼠注射纯化的重组 HMGB1（10～50μg/只），2 h内即出现内毒素血症症状 ，包括嗜睡、腹泻等。大剂量（500 μg/只）给予，则5只受试鼠中3只分别在 18、30、36 h死亡 ，用带有缺陷 HMGB1 cDNA转化的大肠杆菌中提纯出来的蛋白质片段给予对照组小鼠，则未出现内毒素血症，证明观察到的毒性反应是HMGB1所特有的。Abraham等［7］发现经气管给小鼠注入HMGB1后发现，肺组织局部中性粒细胞聚集、间质水肿，同时炎症细胞因子如 IL-1β、TNF-α、M IP-2等表达明显增多，且呈剂量依赖效应。研究发现，HMGB1可通过内分泌和旁分泌形式作用于单核细胞、内皮细胞等，使其表达一系列炎性介质和炎症因子。这些炎性介质和炎症因子又可进一步促进HMGB1的释放，从而形成恶性循环，导致炎症反应逐级放大［6］。

本研究结果显示，大潮气量组肺组织 HMGB1 mRNA及其蛋白表达水平较对照组和小潮气量组明显增高（均P＜0.01），说明HMGB1在VILI的发病中可能具有重要作用，但其具体作用机制目前尚不完全清楚。有文献报道，RAGE（receptor for advanced glycation end products）是目前已知的HMGB1的高亲和力受体，它是一种跨膜蛋白，能结合多种配体。HMGB1与RAGE在细胞表面结合，激发细胞内 p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases）、细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）、NF-κB等多种信号转导机制，从而使细胞释放其他因子［8］。已有研究证实大潮气量机械通气可使局部肺组织炎症细胞聚集、活化，并释放多种炎症介质和细胞因子，推测大潮气量机械通气可能直接启动了 HMGB1mRNA转录，产生HMGB1由于其自身的毒性导致肺损伤，同时产生的HMGB1参与了其他炎症介质和细胞因子的活化，这些炎症介质和细胞因子进一步导致HMGB1mRNA及其蛋白的高表达，从而生成大量内源性 HMGB1导致肺组织的进一步损伤。尽管研究发现HMGB1在脓毒症中是一种重要的晚期炎症因子，但HMGB1可能早期就参与了VILI的发生。对照组和小潮气量组上述各指标比较差异无统计学意义（均P＞0.05），说明小潮气量机械通气对正常肺组织无明显影响。

综上所述，大潮气量机械通气可使肺组织HMGB1 mRNA及其蛋白表达水平明显增高，从而产生大量的HMGB1参与了VILI的发生，但其具体作用机制还有待进一步研究。

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