莲芝消炎胶囊质量标准的研究

林 彤， 成 琳

(广州市药品检验所，广东广州510160)

莲芝消炎胶囊由穿心莲和山芝麻两味药材经提取制成，具有清热，解毒，消炎之功效，用于肠胃炎，支气管炎，扁桃体炎，咽喉炎，肺炎等。该品种为国家二级中药保护品种，其质量标准收载于中华人民共和国卫生部《药品标准》中药成方制剂第十二册［1］。原标准有山芝麻和穿心莲的薄层色谱鉴别及采用滴定法测定穿心莲总内酯的含量。由于含量测定方法操作繁琐，专属性差以及原山芝麻薄层色谱鉴别阴性对照有干扰等原因，本实验对山芝麻和穿心莲的薄层色谱鉴别及穿心莲含量测定方法进行了修订，改用高效液相色谱法测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，有效地控制该品种的质量。

1 仪器与试药

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪;二极管阵列检测器;Millipore Milli-Q纯水器;Mettler Toledo万分之一、十万分之一及百万分之一电子天平。

脱水穿心莲内酯对照品:(批号:0854-200204，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供)。

穿心莲内酯对照品:(批号:0797-200106，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供)。

甲醇为色谱纯，水为超纯水，中性氧化铝(层析用，200～300目，上海新诚精细化工有限公司，批号:200108)，其余试剂均为分析纯。

莲芝消炎胶囊(批号:C25076;C27006;C27008;C27009;20050806;20051002;20060101;20060104;050309;051103)，由广州白云山光华制药股份有限公司、广东省惠州九惠制药厂和广东省惠州市中药厂提供。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 山芝麻 取本品4粒，倾出内容物，用60%乙醇10 mL溶解，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加入乙酸乙酯振摇提取两次，每次15 mL，分取乙酸乙酯液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取山芝麻对照药材3g，用60%乙醇50 mL加热回流1 h，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水10 mL使溶解，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(15∶2∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%硫酸铈的10%硫酸乙醇溶液，105℃加热5 min，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。

本次修订过程中增加了山芝麻阴性对照，结果显示按原标准方法山芝麻阴性对照有干扰。参考文献［2］比较了不同展开剂和显色剂的薄层色谱效果，优选出色谱条件如上所述，显示展开效果较好，山芝麻特征斑点Rf值适中，山芝麻阴性对照无干扰，供试品薄层色谱中与山芝麻对照药材主斑点基本一致，见图1。

图1 山芝麻的薄层鉴别色谱图(修订后的方法)

2.1.2 穿心莲 取穿心莲叶对照药材0.5 g，加乙醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至约5 mL，作为对照药材溶液。另取脱水穿心莲内酯对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录ⅥB)试验，吸取［含量测定］项下的供试品溶液8 μL、对照药材溶液8 μL及对照品溶液4 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(4∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点;喷以2%3，5-二硝基苯甲酸乙醇溶液-2 mol/L氢氧化钾溶液(1∶1)混合溶液(临用时配制)，立即在日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

参照《中国药典》2005年版一部“穿心莲片”的薄层鉴别方法［3］549-550作了修改，以脱水穿心莲内酯对照品作对照，采用穿心莲叶对照药材以增加该鉴别的专属性。部分供试品溶液在与穿心莲对照药材色谱相应的位置上，只显脱水穿心莲内酯斑点而未显穿心莲内酯的斑点。这是由于穿心莲内酯对热不稳定，高温干燥时部分转化为脱水穿心莲内酯［4］，因而采用高温浓缩干燥(减压干燥)工艺制得的成品，其供试品薄层色谱中脱水穿心莲内酯斑点清晰而穿心莲内酯斑点不明显(穿心莲内酯的有无在HPLC含量测定中将得到进一步确证)，采用低温干燥(浮化床干燥)工艺则均显示有脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯斑点。穿心莲干浸膏阴性对照无干扰，薄层色谱图见图2。

2.2 穿心莲含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取穿心莲内酯对照品、脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含8 μg和50 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，室温浸泡1 h，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL(剩余滤液供［鉴别］用)，置中性氧化铝柱(200～300目，3 g，内径1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脱，收集洗脱液，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

图2 穿心莲的薄层鉴别色谱图

2.2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:DiamonsilTM钻石 C18(200 mm × 4.6 mm，5 μm)No:8022889;柱温:40 ℃;流动相:甲醇-水(60 ∶40)，流速:1 mL/min;穿心莲内酯检测波长为225 nm，脱水穿心莲内酯检测波长为254 nm。理论板数按脱水穿心莲内酯峰计算应不低于6 000，供试品液相色谱图见图3～6。

图3 穿心莲内酯HPLC色谱图

图4 脱水穿心莲内酯HPLC色谱图

2.2.4 专属性 精密称取缺穿心莲干浸膏的模拟样品0.2g，按含量测定方法制备供试液并进行测定，液相色谱图见图6，在与穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品色谱峰相应的位置上，未见有色谱峰，说明处方中的其他成分对测定不造成干扰。

图5 莲芝消炎胶囊供试液HPLC色谱图(批号20060104)

图6 穿心莲干浸膏阴性HPLC色谱图

2.2.5 线性 精密吸取穿心莲内酯对照品溶液(0.15 mg/mL)0.5、1、3 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得穿心莲内酯对照品溶液①、②和③。精密吸取穿心莲内酯对照品溶液①1、5 μL，对照品溶液②1、5、10、20、30 μL，对照品溶液③20、30 μL，进样，依法测定，以穿心莲内酯的量 C(μg)为横坐标，相应峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程:A=2 066 742.98C－1 052.04，r=0.999 997。结果表明穿心莲内酯在0.007 5～1.35 μg范围内线性关系良好。

精密吸取脱水穿心莲内酯对照品溶液(0.05 mg/mL)2、5、10、20、30 μL，进样，依法测定，以脱水穿心莲内酯的量C(μg)为横坐标，相应峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程:A=1 618 179.68C －2 969.27，r=0.999 95。结果表明脱水穿心莲内酯在0.1～1.5 μg范围内线性关系良好。

2.2.6 耐用性试验

2.2.6.1 提取方法的选择 参照《中国药典》2005版一部“穿心莲片”［含量测定］项下的方法，比较“精密量取续滤液10 mL置中性氧化铝柱(200～300目，5 g，内径1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脱，收集洗脱液，置50 mL量瓶中”与“精密量取续滤液5 mL置中性氧化铝柱(200～300目，3 g，内径1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脱，收集洗脱液，置25 mL量瓶中”所测得脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的量，结果显示两种处理方法所得到的结果差异不大(见表1)，采用后一种方法可节省吸附剂和洗脱溶剂。在此基础上再用甲醇20 mL或40%甲醇20 mL洗脱，收集洗脱液，置25 mL量瓶中，按含量测定方法制备供试液并进行测定，未检出穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯或所得含量极低，不影响定量结果，说明甲醇20 mL可基本洗脱完全，由此确立供试品溶液的制备方法如2.2.2项下方法。吸附剂用量比较见表1。

表1 吸附剂用量的比较

2.2.6.2 色谱柱的考察 方法中分别采用不同品牌的色谱柱测定样品，结果见表2。

结果显示，所选用的两种色谱柱均达到方法系统适用性的要求，实际应用中还会使用其他不同品牌的色谱柱，未能一一考察，考虑到部分企业样品的色谱图中脱水穿心莲内酯峰旁还有一小杂质峰，柱效降低时会并入脱水穿心莲内酯峰内，影响定量，因此系统适用性试验中以脱水穿心莲内酯峰计算理论板数，定为不得低于6 000。

表2 两种C18柱比较

2.2.6.3 稳定性考察 取同一份供试品溶液(批号:20060104)，在室温放置0、2、4、6、8、12 h 后分别进样，依法测定，计算脱水穿心莲内酯平均含量为0.044 08 mg/mL，RSD 为2.1%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内测定结果基本稳定。

取同一份供试品溶液(批号:20060104)，在室温放置 0、1、2、3、5、6、8、9、15 h 后分别进样，依法测定，计算穿心莲内酯平均含量为2.598 8 μg/mL，RSD为2.1%(n=9)，表明供试品溶液在15 h内测定结果基本稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批号(批号:20060104)样品，精密称取6份，按2.2.2项制备供试液并进行测定。脱水穿心莲内酯的平均含量为27.819 9 mg/g，RSD为2.3%(n=6);穿心莲内酯的平均含量为1.546 8 mg/g，RSD为2.3%(n=6)。

2.2.8 准确度(以加样回收率表示) 取已知含量(批号:20060104)的样品0.1 g，精密称取6份，各精密加入脱水穿心莲内酯(23.103 mg/200 mL)对照品溶液25 mL，称定重量，按2.2.2项下方法制备供试液，依法测定，计算回收率，结果见表3，平均回收率为99.1%，RSD为2.8%(n=6)。

表3 脱水穿心莲内酯回收率试验结果

取已知含量(批号:20060104)的样品0.1 g，精密称取7份，各精密加入穿心莲内酯(1.411 mg/200 mL)对照品溶液25 mL，称定重量，按2.2.2项下方法制备供试液，依法测定，计算回收率，结果见表4，平均回收率为99.8%，RSD为1.9%(n=7)。

表4 穿心莲内酯回收率试验结果

2.2.9 样品含量测定 取收集到的10批样品，每批样品平行取样两份，按2.2.2项下方法制备供试液，分别精密吸取对照品溶液10 μL，供试品溶液5～20 μL，注入液相色谱仪，测定，每份样品平行测定两次，计算供试品中脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果(n=4)

3 讨论

3.1 从10批样品的测定数据可见，不同企业产品的含量差异较大，部分企业不同批次的样品含量差异也较大，分析原因一方面穿心莲叶药材的质量差异较大，各企业制备穿心莲浸膏的设备不同，使原料中穿心莲内酯的总量差异较大;另一方面处方中穿心莲总内酯量是按穿心莲干浸膏经滴定法测定穿心莲总内酯的含量，换算成相当于穿心莲总内酯60 g投料，测定方法专属性不强，滴定终点较难判断，导致穿心莲干浸膏投料量不够准确，因此有必要建立专属性强的方法取代滴定法。

3.2 《中国药典》2005版一部“穿心莲”药材［3］189-190含量测定是在225 nm波长下测定穿心莲内酯的含量及在254 nm波长下测定脱水穿心莲内酯含量，以两者的总量评价药材的质量。由于穿心莲内酯的热不稳定性，“穿心莲片”制剂含量测定只在254 nm波长下测定脱水穿心莲的含量。在制定本品种含量方法之初由于所收集的样品中穿心莲内酯的量较低，与脱水穿心莲内酯含量相差悬殊，因而只测定了成品中脱水穿心莲内酯的含量，随后收集到部分厂家的样品及穿心莲干浸膏，发现由于采用不同的干燥设备所得穿心莲干浸膏中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的比例有很大差异，采用低温干燥(浮化床干燥)所得穿心莲干浸膏中穿心莲内酯含量较高，脱水穿心莲内酯的含量较低，采用高温浓缩干燥(减压干燥)则反之。提示穿心莲内酯对热不稳定，高温干燥时部分转化为脱水穿心莲内酯。因此最后建立同时测定脱水穿心莲内酯和穿心莲内酯的含量，以两者含量之和为评价指标较为客观、合理。

［1］中华人民共和国卫生部《药品标准》中药成方制剂［S］.第十二册.1997:152.

［2］文东旭，冯 枫.山芝麻的薄层色谱鉴别研究［J］.广西医学，2003，25(12):2434-2435.

［3］中国药典［S］.一部.2005.

［4］曾惠芳，黄晓丹，苏子仁，等.试析穿心莲片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的变异因素［J］.中药新药与临床药理，2006，17(4):299-301.