环氧合酶-2对胃癌淋巴管形成的影响

黄国民,刘林林,乔士兴,房学东*

(吉林大学第二医院1.普通外科疾病诊疗中心;2.肿瘤生物治疗中心,吉林长春130041)

淋巴转移是胃癌转移的主要途径,也是影响术后复发及判断预后的重要指标。环氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶,参与胃癌的发生发展,促进胃癌的淋巴结转移[1]。肿瘤细胞通过淋巴管扩散到区域淋巴结是癌细胞侵袭性的重要表现,在癌组织切片中可见未成熟期淋巴管,在这些淋巴管中经常可以见到成簇的肿瘤细胞,提示肿瘤诱导的淋巴管生成可能是转移进展的重要因素[2]。但有关COX-2对淋巴管形成的影响研究甚少,其具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨COX-2对胃癌淋巴管形成及预后的影响,并对其可能的机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 对象与试剂

1.1.1 患者资料 收集我院2004年2月-2004年10月临床资料完整的手术切除的并经病理证实的胃癌患者63例,其中男性为40例,女性为23例。年龄29岁-75岁,中位年龄54岁。所有标本术前均未接受放疗和化疗。组织学检查为正常胃粘膜者20例源于胃镜活检标本。病理类型:高分化腺癌13例,中分化腺癌15例,低分化腺癌26例。TNM 分期:I期8例,II期13例III期18例IV期19例。本组63例均获临床随访,随访时间58-76个月,患者生存时间8-76个月,中位生存时间37个月。

1.1.2 主要试剂 人胃腺癌细胞系SGC7901购自中科院上海生物研究所,尼美舒利购于Sigma公司,前列腺素E2(PGE2)购于美国Cayman化学公司,羊抗人COX-2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,羊抗人VEGF-C单克隆抗体、VEGFR-3单克隆抗体购于武汉博士德生物技术开发公司,Western印迹法试剂盒购于美国Promega公司。VEGF-C上游引物5′-AGACTCAATGCATGCCACG-3′,5′-TTGAGTCATCTCCAGCATCC-3(435 bp)。β-actin:5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′,5′-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′(479 bp)。引物由上海生工公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 COX-2、VEGF-C、VEGFR-3 免疫组织化学检测及淋巴管密度计数:按S-P免疫试剂盒说明书操作。COX-2、VEGF-C以细胞质染色为棕或棕褐黄色为阳性细胞,计算每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率,小于10%判定为阴性(-),大于10%判定为阳性(+)。VEGFR-3染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均为一个为微淋巴管计数,每例首先在低倍镜下选择MLD最高的肿瘤区域,在200倍光镜下,随机计数5个视野内微淋巴管数,再求其平均值,MLD以±s表示。

1.2.2 不同浓度尼美舒利对VEGF-C mRNA及蛋白表达的影响:用0、50、100和200 μ mol/L的尼美舒利作用细胞48 h,收集细胞,置于-80℃保存备用。提取mRNA进行定量和定性分析。RT-PCR:采用TRlzol一步法抽提胃癌组织总RNA,经DNA酶消化后逆转录。逆转录和PCR均设阴性对照。取5 μ l扩增产物加1 μ l溴酚蓝,2%琼脂糖电泳分析,凝胶成像仪分析逆转录PCR产物带的积分吸光度值。用VEGF-C/β-actin扩增量表示细胞的相对表达水平。

分别用 0、50、100 、和 200 μ mol/L 尼美舒利作用SGC-7901细胞48 h。加入4℃蛋白裂解液,冰上裂解3 min;4℃1 000 g离心10 min;取上清,考马斯亮蓝测蛋白浓度,-80℃保存。取相同剂量的蛋白质样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后转至硝酸纤维膜,5%脱脂奶粉封闭缓冲液室温封闭30 min,加入1∶500稀释的VEGF-C一抗,4℃孵育过夜。用Western印迹试剂盒检测VEGF-C蛋白表达水平。

1.2.3 不同浓度的PGE2对SGC-7901细胞VEGF-C蛋白表达的影响:SGC-7901细胞分别加入浓度为0、50 、100、和 200 μ mol/L 的 PGE2,培 养 24 h,收 集细胞,按前述方法检测VEGF-C蛋白表达水平

1.3 统计学处理

所有资料经SPSS10.0统计软件分析。计量资料采用t检验,计数资料采用 χ2检验,相关分析采用Spearman等级相关分析,生存分析采用Kaplan-Meier曲线,单因素分析采用Log-rank检验。P＜0.05为差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 COX-2和VEGF-C在胃癌中的表达及VEGFR-3标记的淋巴管特点

COX-2、VEGF-C在正常胃粘膜组未见表达。COX-2在胃癌组织中阳性率分别为77.6%(66/85),其阳性产物为棕黄色,位于癌细胞胞浆内;VEGF-C在胃癌组织中阳性率分别为72.9%(62/85),其阳性产物为棕黄色,位于癌细胞胞浆内,两者差异具有显著性(P＜0.05)。VEGFR-3阳性产物表达于肿瘤间质淋巴管内皮细胞胞浆中,淋巴管分布肿瘤周边多于间质,形态大小不一;部分淋巴管内可见癌细胞浸润。VEGFR-3在胃癌组织中MLD为(8.94±0.90)正常胃粘膜组MLD为(2.11±0.91),两组相比,差异具有显著性(P＜0.05)。

2.2 COX-2与VEGF-C、MLD的表达关系

COX-2表达阳性的49例胃癌中有VEGF-C表达阳性的有42例,COX-2表达阴性的14例胃癌中有VEGF-C表达阳性的有 3例,两者比较COX-2与VEGF-C表达呈显著正相关(P＜0.05)。COX-2表达阳性的49例胃癌中平均MLD为12.05±0.21,而阴性的14例中MLD为5.13±0.29两者比较差异有显著性(P＜0.05)。

2.3 COX-2、VEGF-C与胃癌淋巴管形成和淋巴结转移的关系

淋巴管密度与 COX-2(r=0.41,P=0.01)、VEGF-C(r=0.45,P＜0.01)、淋巴结转移(r=0.69,P＜0.01)呈正相关。COX-2表达阳性的66例胃癌中有VEGF-C表达阳性的有57例,COX-2表达阴性的19例胃癌中有VEGF-C表达阳性的有2例,COX-2与VEGF-C表达呈显著正相关(P＜0.05)。

2.4 COX-2、VEGF-C与胃癌预后的分析

经Kaplan-Meier生存曲线分析COX-2、VEGF-C表达均与生存率负相关,COX-2阳性表达组患者5年生存率15.6%阴性表达患者为36.8%,VEGF-C阳性表达组患者5年生存率16.8%阴性表达患者为35.7%,log-rank检验两组生存曲线差异有非常显著性意义(P＜0.05)。

2.5 COX-2对淋巴管形成的影响

选择性COX-2抑制剂尼美舒利以剂量依赖性方式抑制SGC-7901胃癌细胞VEGF-C mRNA的表达。加入不同剂量的PGE2后,PGE2以剂量依赖性方式上调VEGF-C的表达,PGE2浓度越高,VEGF-C mRNA表达越明显。

3 讨论

环氧合酶-2(COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶,在多种恶性肿瘤中表达上调,COX-2参与胃癌的发生、发展过程与淋巴结转移密切相关[1,3]。有研究发现在人结肠癌中COX-2可通过上调VEGF-C表达,促进结肠癌的淋巴管形成[4]。然而,COX-2能否通过上调VEGF-C表达并促进胃癌淋巴管形成以及胃癌淋巴结转移目前尚不清楚。

VEGF-C被认为是相对特异的淋巴管内皮生长因子,在对影响淋巴转移的相关因素的研究中发现,VEGF-C及VEGFR-3是目前为止发现的一组调节胚胎组织淋巴管生成和成熟个体淋巴管生理功能的调节因子,它通过诱导微淋巴管的生成并影响淋巴管内皮的通透性,从而促进肿瘤转移[5]。本研究表明VEGF-C与淋巴管密度、淋巴结转移呈正相关,与生存率呈负相关,并影响胃癌患者的预后,COX-2表达与VEGF-C表达呈正相关。COX-2表达和VEGF-C表达与淋巴管密度呈正相关。有淋巴结转移的患者COX-2、VEGF-C的表达明显增高,并与患者的无病生存率和总生存率呈负相关。淋巴管密度是胃癌预后的独立危险因素,提示COX-2和VEGF-C的高表达与胃癌淋巴管形成、淋巴结转移密切相关,并影响胃癌患者的预后。

COX-2和VEGF-C在胃癌淋巴转移过程中发挥的确切机制和关键步骤,迄今仍未明了。有研究认为少数COX-2为调节基因,推测某些未知的COX-2下游基因可能在肿瘤转移中扮演重要角色。我们研究结果表明,胃癌组织中COX-2表达与VEGF-C呈正相关,COX-2特异性抑制剂尼美舒利可明显抑制SGC-7901胃癌细胞VEGF-C mRNA和蛋白的表达,尼美舒利浓度越高,VEGF-C表达降低越明显,其抑制效果呈剂量依赖性。另一方面细胞培养液中加入PGE2,可诱导VEGF-C表达上调,实验表明,VEGF-C是COX-2的下游基因,COX-2通过PGE2上调VEGFC的表达,VEGF-C通过作用与内皮细胞上的受体,进而促进淋巴管的形成及淋巴结转移。随着COX-2、VEGF-C与胃癌关系研究的深入有可能为研究肿瘤的淋巴转移开辟新的途径。

[1]黄国民,房学东,丁相福,等.胃癌组织中环氧和酶-2的表达及意义[J].中国实验诊断学,2008,12(8):1020.

[2]Sebastian FS,Guenther B,Klaus A,Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer[J].Ann Surg USA,2004,240(2):306.

[3]Duff SE,Li C,Jeziorska M,et al.Vascular endothelial growth factors C and D and lymphangiogenesis in gastrointestinal tract malignancy[J].Br J Cancer,2003,89:426.

[4]Soumaoro LT,Uetake H,Takagi Y,et al.Coexpression of VEGF-C and Cox-2 in human colorectal cancer and its association with lymph node metastases[J].Dis Colon Retum,2006,49:392-398.

[5]Zha S,Yegnasubramanian V,Nelson WG,etal.Cyclooxygenase-2in cancer progress and perspective[J].Cancer Lett,2004,215(1):1.