快速高分离液相色谱-串联质谱法对肌肉组织中糖皮质激素残留的检测

高文惠，李 挥，张敬轩

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北省 石家庄 050018；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北省 石家庄 050051)

快速高分离液相色谱-串联质谱法对肌肉组织中糖皮质激素残留的检测

高文惠1，李 挥2，张敬轩2

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北省 石家庄 050018；2.河北省食品质量监督检验研究院，河北省 石家庄 050051)

建立采用快速高分离液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS2)技术检测肌肉组织中糖皮质激素残留的方法。样品经乙酸乙酯提取，固相萃取法净化，以C18色谱柱(150mm×2.1mm，3.5μm)为分离柱，水-乙腈-甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，快速高分离液相色谱-串联质谱ESI负离子模式进行检测。该方法线性范围为0.5～5ng/mL，线性相关系数R2≥0.9963，检测限：倍氯米松为1.0μg/kg，氢化可的松为2.0μg/kg，其余均为0.5μg/kg。平均回收率为82.75%～91.87%，相对标准偏差≤4.43%(n=5)。

糖皮质激素；固相萃取；液相色谱-串联质谱法

目前国内外对糖皮质激素残留的检测方法主要有高效液相色谱法[1-3]、气相色谱-质谱联用法[4]、液相色谱-质谱联用法[5-12]。动物性食品中糖皮质激素残留分析精度和检测要求越来越高，而高效液相色谱法的灵敏度较低，选择性和特异性差，故不适于痕量兽药残留检测要求；采用气相色谱-质谱联用法通常需对样品进行衍生化处理，操作繁琐；而应用液相色谱-质谱法样品无需衍生化，且能够很好地对分析物进行定性确认，目前已成为检测糖皮质激素残留的首选方法，而且串联质谱技术可以更为有效地去除基质中的干扰，保证痕量物质分析的准确性。本实验采用快速高分离液相色谱-串联质谱法对肌肉组织中糖皮质激素残留进行测定，以期为肌肉组织中糖皮质激素残留方法的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

50种猪肉肌肉组织，由河北省内各地超市和市场随机抽取。随机抽取的样品用冷冻车运输或置于干冰冷冻箱中运送，于实验室－20℃下保存。

乙睛为色谱纯；正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、氢氧化钠均为分析纯；糖皮质激素标准品(纯度均大于98.0%)：倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸地塞米松(f l u d r o c o r t i s o n e A c e)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone) 美国Sigma公司。

标准储备液：分别准确称取0.1g糖皮质激素类药物标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分别配制成1000μg/mL的溶液作为贮备液。－20℃以下保存。混合标准工作液：准确量取糖皮质激素类药物标准贮备液适量，用20%乙腈-水溶液稀释成适宜质量浓度的混合标准工作液，现配现用。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200超快速液相色谱-6410串联质谱联用仪(配电喷雾离子源) 美国Agilent公司；固相萃取装置美国Supelco公司；CT15RT高速冷冻离心机、组织捣碎机 美国KAI公司；XH-B旋涡混匀器 江苏康健医疗用品有限公司；氮吹仪 英国STK公司。

1.3 样品的前处理

1.3.1 提取

称取50种肌肉组织(2±0.05)g于50mL离心管中，加乙酸乙酯15mL，旋涡混合，15000r/min离心5min，移取乙酸乙酯层。于残渣中加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL，混匀，加乙酸乙酯20mL，漩涡混合，200r/min摇床振动15min，15000r/min离心5min，移取乙酸乙酯层。合并两次提取液，40℃旋转蒸至近干，加乙酸乙酯1mL和正己烷5mL，溶解残渣，待净化。

1.3.2 净化

用6mL正己烷活化固相萃取柱，提取液过柱。用正己烷6mL淋洗萃取柱，抽干，用正己烷-丙酮(6:4，V/V)6mL洗脱。洗脱液50℃氮气吹干，加20%乙腈-水溶液0.5mL，溶解残渣，转入1.5mL离心管中，15000r/min离心20min，取上清液，过0.22μm滤膜，超快速液相色谱-串联质谱法测定。

1.4 色谱和质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；流动相：A：水，B：乙腈，C：0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1；柱温40℃； 进样量20μL。外标法定量。

表1 流动相梯度洗脱条件Table1 Gradient elution program

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：选择反应监测；喷雾电压：4000V；离子传输管温度：330℃；鞘气压力：40bar。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱行为

为了提高分析的灵敏度和专一性，选用多反应监测模式(MRM)进行检测，同时检测两对传输离子通道，进行定性和定量分析。7种糖皮质激素的定性和定量离子对列于表2中。

表2 糖皮质激素的保留时间和定性、定量离子对Table2 Retention time as well as quantitative and qualitative ion-pairs for seven glucocorticoids

图1 混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed solution of five glucocorticoids

在1.4节色谱和质谱条件下，7种糖皮质激素混合标准溶液色谱图(图1)，由图1可以看出，除泼尼松龙、氢化可的松和泼尼松外，其他糖皮质激素实现了良好分离。7种糖皮质激素二级质谱图如图2所示。

2.2 线性范围与检测限

将糖皮质激素类药物标准贮备液分别配制成质量浓度为0.25、0.5、1、2、5ng/mL的溶液，以峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程和线性相关系数见表2。结果表明本方法在0.5～5ng/mL范围呈良好线性关系，线性相关系数R2≥0.9963，检测限(RSN=3)在0.5～2.0μg/kg之间。

表2 糖皮质激素的线性关系和检测限Table2 Linear regression equations and detection limits of seven glucocorticoids

2.3 回收率和精密度

在空白试样中加入2.0μg/kg和5.0μg/kg的混合标准溶液，进行回收率实验，并考察实验方法的精密度。结果见表3。

由表3可以看出，7种糖皮质激素平均回收率在82.75%～91.87%之间，RSD为2.15%～4.43%。说明本方法的回收率和精密度良好。

表3 不同添加水平回收率和精密度实验结果(n=5)Table3 Results of recovery and precision tests (n=5)

2.4 样品测定

分别对50批次猪肉肌肉组织样本进行编号：1#，2#、3#……49#、50#。倍氯米松、倍他米松、地塞米松、醋酸地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙和泼尼松检测结果均未检出。随机选取一个样本的色谱图，图3显示1#肌肉组织样本的色谱图，由图3可以看出7种糖皮质激素均未检出。

图3 1#样本色谱图Fig.3 Chromatogram of pork sample 1#

3 结 论

采用UHPLC-MS-MS技术建立肌肉组织中糖皮质类激素残留的检测方法，组织样品用碱水解，乙酸乙酯提取，提取液经固相萃取柱净化，快速高分离液相色谱-串联质谱ESI负离子模式进行检测。使用本方法进行测定时，糖皮质激素在0.5～5ng/mL浓度范围内，具有良好的线性关系，线性相关系数(R2)≥0.9963，检测限在0.5～2.0μg/kg之间。在空白试样中的添加浓度为2.0μg/kg和5.0kg时，平均回收率为82.75%～91.87%，RSD为2.15%～4.43%，说明本方法的回收率和精密度良好。

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Determination of Glucocorticoid Residues in Animal Muscle by Rapid Resolution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GAO Wen-hui1，LI Hui2，ZHANG Jing-xuan2
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. Hebei Institute of Food Quality Supervision, Inspection and Research, Shijiazhuang 050051, China)

A method was developed for the determination of seven glucocorticoid residues in animal muscle using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Sample extraction was performed using ethyl acetate, followed by cleanup based on solid phase extraction (SPE). The chromatographic separation was achieved on a C18column (150 mm×2.1 mm, 3.5μm) with water/acetonitrile/formic acid system as the mobile phase in gradient elution mode. The MS condition used was negative electrospray ionization mode. Under these conditions, the linear range of the developed method was between 0.5 ng/mL and 5 ng/mL, with a linear correlation coefficient of no less than 0.9963, the detection limit was 1.0μg/kg for beclomethasone, 2.0 μg/kg for hydrocortisone, 0.5μg/kg for the others, and the average spike recoveries for the seven molecules were between 82.75% and 91.87%, with a relative standard deviation (RSD) of 4.43% or lower (n = 5).

glucocorticoid；solid phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS207.3

A

1002-6630(2010)20-0382-04

2010-06-13

河北省科技厅重大科技攻关项目(09227134D)；河北省科技支撑计划项目(10276902D)；河北省自然科学基金项目(B2008000669)

高文惠(1963—)，女，教授，博士，研究方向食品安全与分离科学。E-mail：wenhuigao@126.com