沙棘叶多酚在苹果汁保鲜中的应用

敬思群

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

沙棘叶多酚在苹果汁保鲜中的应用

敬思群

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

以沙棘叶为原料，多酚提取率作为考察指标，通过单因素及正交试验确定超声波辅助提取法提取沙棘叶多酚的最佳工艺条件，同时研究了沙棘叶多酚对天然苹果汁VC保存的影响。结果表明，超声波辅助提取法最佳工艺条件为乙醇体积分数60%、浸提时间25min、料液比1:16。在此最佳工艺条件下，沙棘叶多酚提取量为7.385mg/g。沙棘叶多酚在苹果汁中的添加量为0.10%(质量分数)时，保鲜作用显著。

多酚；超声波；提取；保鲜

新疆沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种植总面积约49.95万亩，主要分布于尼勒克、新源、阿勒泰、阿克苏、喀什、和田等地，主要的类型为蒙古沙棘和中亚沙棘。国内外对沙棘果实的研究已经趋于成熟[1-3]，但对沙棘叶开发利用还比较少。而沙棘叶含有丰富的多酚，可防治心血管疾病、可抗癌抗突变、可治疗皮炎、有降血糖、降血压、抗病毒等多种作用[4-6]。由于沙棘枝多刺，因此人们采摘为连枝采摘，在沙棘果的制备过程中产生大量的枝叶，并作为废弃物被丢弃了，不仅污染环境，而且造成资源的严重浪费。因此，本研究利用废弃的枝叶作原料提取沙棘多酚，并用之于苹果保鲜研究，不仅增加了天然保鲜剂的市场品种[7-8]，而且变废为宝，提高了沙棘的附加值，延长沙棘产业链，具有深远的现实意义和经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

沙棘叶采自新疆吉木萨尔县，低温干燥，备用；沙棘叶多酚由本实验室制备；化学试剂均为分析纯。

KQ-250DE型数控超声波清洗器；HH-S型恒温水浴锅；离心机；旋转蒸发仪；冷冻干燥机；MDF-382E超低温冰箱；BS 2000S型电子精密天平；JFSD-70粉碎磨；WFZUV-2000紫外-可见分光光度计；电冰箱；打浆机等。

1.2 方法

1.2.1 沙棘叶前处理

将沙棘叶用水清洗并经自然风干或60℃烘干后，粉碎成40目，密封避光低温保存。

1.2.2 浸提溶剂的确定

多酚类物质在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形成稳定的分子复合物[9-10]。多酚提取溶剂主要是水、乙醇、甲醇及丙酮等。水是一种强极性溶剂，便宜且使用安全。但水断裂氢键的作用较弱，并且提取多酚的同时，原料中的一些水溶性物质也一同提

取出来，增加后处理的困难。亲水性的乙醇、甲醇及丙酮提取多酚时，与水相比，杂质少，提取时间短，效率高。并且乙醇易于回收，因此本实验采取易回收的乙醇为提取溶剂。

1.2.3 沙棘叶多酚的制备工艺流程[11-12]

称取样品→加入溶剂→搅拌均匀→超声波浸提→离心→抽滤→减压旋转蒸法→冷冻干燥

1.2.4 超声波辅助提取多酚单因素试验

1.2.4.1 浸提时间对多酚提取率的影响

称取1g沙棘叶，在初始温度为30℃，超声波功率100W，乙醇体积分数60%，料液比1:20，分别浸提15、20、25、30、35min，将离心抽滤后的滤液减压旋转蒸发后定容，测定吸光度。

1.2.4.2 料液比对多酚提取率的影响

称取1g沙棘叶，在初始温度为30℃，超声波功率100W，乙醇体积分数60%，料液比(g/mL)分别为1:10、1:12、1:14、1:16、1:18，浸提25min，其他同1.2.4.1节。

1.2.4.3 溶剂体积分数对多酚提取率的影响

称取1g沙棘叶，在初始温度30℃，超声波功率100W，料液比1:16，乙醇体积分数分别为0%、20%、40%、60%、80%浸提25min，其他同1.2.4.1节。

1.2.5 超声波辅助提取多酚正交试验

选择三因素三水平L9(33)正交试验设计，研究浸提时间，溶剂体积分数，料液比对沙棘叶多酚提取率的影响。

表1 L9(33)正交试验因素水平设计表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.2.6 沙棘叶多酚含量测定

1.2.6.1 没食子酸标准曲线的绘制

Folin试剂：将10.00g钨酸钠、2.50g钼酸钠、70mL蒸馏水、5mL 85%磷酸及10mL浓盐酸装入带回流装置的500mL圆底烧瓶中，充分混合，文火缓慢回流10h。再加入15.00g硫酸锂、5mL蒸馏水及数滴液溴，然后将烧瓶内溶液开口煮沸15min，以便驱除过量的溴。冷至室温后用容量瓶定容至100mL，过滤。滤液呈微绿色，于棕色试剂瓶中冰箱保存。

20%碳酸钠溶液：精确称取20.00g无水碳酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100mL。准确称取0.1250g没食子酸于小烧杯中，用少量无水乙醇溶解，转移至100mL容量瓶中并用去离子水定容至刻度。移液管分别取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于6个100mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。分别移取不同质量浓度(g/mL)的标准溶液1.0mL加入到25mL容量瓶中，依次加入15mL去离子水，混合；加入1mL Folin试剂进行混合；在0.5～8min内，加入3mL 质量分数20%碳酸钠溶液，充分混合后用水定容至刻度。2h后，以空白作参比，在765nm波长处测定其吸光度。以没食子酸的质量浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标，绘制成标准曲线，实验得没食子酸与吸光度回归方程为：A=0.0648C－0.0062，r=0.9997，在1.9～10μg/mL范围内呈良好线性关系。

1.2.6.2 沙棘叶多酚含量测定[13]

以没食子酸为标准品，采用分光光度法测定。测出沙棘叶多酚提取液的吸光度，参照没食子酸标准曲线计算多酚含量。

1.2.6.3 沙棘叶多酚含量计算

提取液挥去有机溶剂，用蒸馏水定容。移取1.0mL样液至25mL容量瓶中，加入15mL蒸馏水，混合；加入1mL Folin试剂进行混合；在0.5～8min内，加入3mL 20%碳酸钠溶液，充分混合后用蒸馏水定容至刻度。2h后，以空白作参比，在765nm波长处测定其吸光度。

多酚含量：W=CV/m

式中：W为多酚含量/(mg/g)；C为沙棘叶多酚质量浓度/(mg/mL)；V为提取液体积/mL；m为沙棘叶质量/g。

1.2.7 多酚类物质的保鲜作用研究[14]

1.2.7.1 抗坏血酸标准曲线的制作

精确称取100mg纯抗坏血酸，用1%草酸溶液溶解，移入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，即得1mg/mL的抗坏血酸标准溶液。吸取50mL标准溶液，加1g活性炭，摇动1min，过滤。取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。此抗坏血酸溶液浓度为20μg/mL。取5、10、20、25、40、50、60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1、2、4、5、8、10、12μg/mL。取标准曲线系列7个溶液各25mL，按样品氧化处理、呈色反应和比色步骤进行操作。以吸光度为纵坐标，以抗坏血酸(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。实验得回归方程：A=0.0127C－0.0036，r=0.9996，在1.0～12μg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.7.2 沙棘叶多酚保鲜作用最佳质量分数确定

(1) 苹果汁制备

称100g苹果和100g 2%草酸溶液，倒入打浆机中

打成均浆，取10～40g(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL棕色容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀，得样液。将上述样液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。取25mL上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。

(2) 苹果汁中VC含量测定[15]

上述样品滤液中分别加入0.00%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%(质量分数)的沙棘叶多酚在室温下放3d。取10mL上述各氧化提取液，加入10mL质量分数2%硫脲溶液，混匀，得氧化稀释液。于3个试管中各加入4mL氧化稀释液。一个试管作为空白，在另两试管中加入1.0mL 2%(质量分数)2,4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入(37±0.5)℃恒温箱或水浴中，保温3h。3h后取出，除空白管外，将另两个试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL 2%(质量分数) 2,4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。当试管放入冰水后，向每一试管中慢慢滴加5mL 85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测上述3个试管的的吸光度。

VC含量：采用2,4-二硝基苯肼法[16]测定。

式中：X为样品中VC总含量/(mg/100g)；P为由标准曲线上查得相应的样品溶液质量浓度/(μg/mL)；m为试样质量/g；f为样品溶液的稀释倍数；V为呈色反应所用试样体积/mL。

1.2.7.3 沙棘叶多酚对苹果汁在储藏过程中VC含量变化的影响

在同一个实验条件下比较加沙棘叶多酚的苹果汁和不加沙棘叶多酚的苹果汁(对照)在储藏过程中的VC含量变化。向2支试管中分别移取5mL的苹果汁，其中1支试管按1.2.7.2节实验所得结果加入质量分数0.10%的沙棘叶多酚并混匀，然后于室温避光放置，每隔24h测定一次吸光度。

1.2.7.4 沙棘叶多酚对苹果汁感官品质影响

在苹果汁分别加入0.00、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%(质量分数)的沙棘叶多酚，并从色泽、口感、香味进行感官评定，具体评定等级划分见表2。

表2 感官评定表Table 2 Rating of sensory attributes for apple juice

1.2.7.5 沙棘叶多酚对苹果汁外观褐变程度的影响

取新鲜苹果榨汁后经四层纱布过滤，再4000r/min离心20min，取上清液备用。

分别将0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的沙棘叶多酚添加到上述处理好的苹果汁(上清液)中，每隔2h，取1mL添加沙棘叶多酚的苹果汁按1:5稀释后在420nm处测定吸光度，同时以不添加沙棘叶多酚的苹果汁做空白，观察变化，并以吸光度作为褐变指数。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助提取法提取工艺参数的确定

2.1.1 浸提时间对多酚提取率的影响

图1 浸提时间对多酚提取的影响Fig.1 Effect of length of extraction time on polyphenol yield

由图1可知，提取初期，沙棘叶细胞内有效成分含量呈现过饱和状态，浓度为提取温度下多酚饱和浓度。随着提取的进行，沙棘叶细胞内多酚含量逐渐向非饱和状态过度，而提取介质中多酚含量却逐渐增大。提取后期，沙棘叶细胞内多酚浓度与提取介质中多酚浓度达到动态平衡。此外，提取过程中多酚长时间处于

高温下，造成部分氧化，因此提取率略有下降。从图1可看出，宜选25min作为最佳提取时间。

2.1.2 料液比对多酚提取率的影响

图2 料液比对多酚提取的影响Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on polyphenol yield

由图2可看出，随着乙醇水溶液体积用量的增加，多酚吸光度先增加后减少，在保证一定提取率基础并从经济技术角度考虑，溶剂量越少越好。这样可降低成本，减少提取液体积，减轻后序工作，故选取料液比1:16为宜。

2.1.3 乙醇体积分数对多酚提取率的影响

图3 乙醇体积分数对多酚提取的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield

从图3可知，乙醇体积分数小于60%时，随着体积分数的增加，沙棘叶多酚提取液的吸光度增加；乙醇体积分数超过60%后，多酚提取液的吸光度随着体积分数的增加而下降。样品为固体时，纯溶剂不足以破坏样品中多酚类物质与蛋白质，多糖或其他物质的连接，多酚提取率低；水比例过高时，糖类等水溶性杂质浸出率也较高，乙醇体积分数过高时，脂溶性成分浸出较多，不利于多酚类物质的提取，因此体积分数以60%为宜。

2.1.4 正交试验结果

对表3中数据进行方差分析[16]，结果由表4可见，因素B显著，因素A和C不显著，因素作用的主次顺序是B＞C＞A，与极差分析得出的结果一致。该法中影响沙棘叶多酚提取的主要因素是乙醇体积分数，其次是浸提时间，料液比影响最小。对表3数据进行分析得出该方法中沙棘叶多酚提取条件最优水平组合为A2B2C2，即乙醇体积分数60%、浸提时间25min、料液比为1:16。验证实验重复做3次，结果见表5。

表3 L9(33)超声波辅助提取工艺正交试验结果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis for polyphenol yield with various extraction conditions

表5 验证实验结果Table 5 Verification of optimal extraction conditions

验证实验表明在最优提取条件下得到的多酚含量为7.385mg/g。

超声波辅助提取法利用超声波机械破碎和空化作用，使植物细胞组织更易破碎，从而加速多酚浸提物从沙棘叶中浸提[17]。同时超声波辅助提取可大大减少多酚长时间处在高温下氧化，保持活性成分的稳定性。

2.1.5 沙棘叶多酚定性实验[18]

多酚能与金属盐类物发生络合反应，生成有颜色的络合物。如多酚与铁盐发生显色反应产生紫蓝色，与三氯化铝或乙酸铅的水溶液显色产生灰黄色沉淀。本实验用FeCl3·6H2O和乙酸铅来定性多酚。称取0.1g FeCl3·6H2O加蒸馏水稀释至100mL，然后加0.1g多酚后产生了紫蓝色络合物。称取0.1g碱性乙酸铅加蒸馏水稀释至100mL，然后加0.1g多酚产生了灰黄色沉淀。这证明提取物是多酚。

2.2 沙棘叶多酚类物质保鲜作用实验

2.2.1 沙棘叶多酚保鲜作用最佳质量分数

图4 多酚质量分数对VC含量的影响Fig.4 Effect of seabuckthorn leaf polyphenol concentration on the content of vitamin C in apple juice after 3 days of storage at ambient temperature

从图4可以看出，沙棘叶多酚的质量分数为0.10%时苹果汁的VC含量最高，此时最大程度保留了苹果汁的VC含量。

2.2.2 沙棘叶多酚对苹果汁在储藏过程中VC含量变化的影响

图5 沙棘叶多酚对苹果汁中VC含量的影响Fig.5 Change of the content of vitamin C in apple juice during storage without and with the presence of seabuckthorn leaf polyphenols

从图5可以看出，不加沙棘叶多酚的苹果汁储藏过程中VC含量迅速下降，但加沙棘叶多酚的苹果汁储藏过程中VC含量的下降速度比不加多酚的低。这可表明多酚对苹果汁储藏过程中有明显的保鲜作用。

2.2.3 沙棘叶多酚对苹果汁感官品质影响

由表6感官评定实验结果得知：沙棘叶多酚添加量为0.10%时，苹果汁口感好；添加量为0.05%和0.10%时，色泽好；皆无涩味，但不失苹果香气。

表6 沙棘叶多酚对苹果汁的感官品质影响Table 6 Effect of the presence of seabuckthorn leaf polyphenols on the mouth feel, color and aroma of apple juice

2.2.4 沙棘叶多酚对苹果汁外观褐变程度的影响

图6 沙棘叶多酚对苹果汁外观褐变程度的影响Fig.6 Browning curves of apple juice with the presence of seabuckthorn leaf polyphenols

从图6看出，在2h以内沙棘叶多酚添加量为0.05%～0.15%时对苹果汁褐变有明显的抑制作用；随着时间的延长，添加量在0.10%和0.05%的苹果汁的褐变指数缓慢增加；这是由于沙棘叶多酚本身的氧化也会导致褐变指数的增加，因此并不是添加量越大越好。在如何有效持久地发挥沙棘叶多酚的抑制褐变的能力的问题上尚需要做进一步的研究。

3 结 论

研究用超声波辅助提取法提取沙棘叶多酚，优化得到最佳提取工艺条件：乙醇体积分数60%，浸提时间25min，料液比1:16。在优化条件下，多酚的提取率为7.385mg/g，并通过VC含量测定、苹果汁感官品质观察、苹果汁外观褐变程度分析等保鲜实验研究了沙棘叶多酚对苹果汁的保鲜效果。当沙棘叶多酚的添加量0.10%时，对苹果汁有明显的保鲜作用，而且苹果汁的口感和色泽优好。沙棘叶多酚添加量为0.05%～0.15%时，在2h以内对苹果汁褐变有明显的抑制作用。

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Ultrasonic-aided Extraction of Polyphenols from Seabuckthorn Leaves and Their Fresh-keeping Effect on Apple Juice

JING Si-qun. ...
(College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Three process conditions (namely, ethanol concentration, solid/liquid ratio and length of extraction time) for the ultrasonic-aided extraction of polyphenols from seabuckthorn leaves were optimized using orthogonal array design on the basis of single factor investigations. Along with this, the extracted polyphenols were added to freshly prepared apple juice in order to evaluate their fresh-keeping effect on fruit juice. The optimal ultrasonic-aided extraction conditions were found to be: ethanol concentration 60%, length of extraction time 25 min and solid/liquid ratio 1:16. The polyphenol yield obtained under such conditions was 7.385 mg/g. The extracted polyphenols added at a level of 0.10% had a significant fresh-keeping effect on apple juice.

polyphenol；ultrasonic；extraction；preservation fresh-keeping

TS202.1

A

1002-6630(2010)18-0147-06

2010-06-24

敬思群(1966—)，女，副教授，硕士，研究方向为食品科学。E-mail：jingsiqun@sina.com