香蕉原生质体的电融合研究

刘代，魏岳荣，胡家金

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128;2.广东省农业科学院果树研究所，广东 广州 510640）

到目前为止，只有3篇关于通过体细胞杂交成功获得香蕉杂种植株的报道[1-3]。本研究以在我国广泛种植的香蕉栽培品种“过山香”（Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang）和具有抗病、抗寒基因的野生阿宽蕉（Musa itinerans Cheesm.AB Group）为材料，探索香蕉电融合的技术参数，旨在通过体细胞杂交为香蕉栽培品种转入抗病、抗寒基因，从而达到改善香蕉品质的目的，为香蕉的体细胞杂交和品种改良提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料香蕉品种“过山香”和野生阿宽蕉。

1.1.2 培养基与酶液（1）悬浮培养基为M2培养基:MS盐+100 mg/L麦芽提取物+100 mg/L谷氨酰胺＋100 mg/L肌醇+1 mg/L生物素＋1 mg/L 2,4-D+45 g/L蔗糖，pH 5.3。（2）看护培养基:MS盐+Morel and Wetmore维生素＋2 mg/L 2，4-D+250 mg/L葡萄糖＋72 g/L麦芽糖＋20 g/L蔗糖＋2 mL/L椰乳，pH 5.7，过滤灭菌。（3）野生阿宽蕉原生质体的分离酶液:3.0%纤维素酶（Cellulase，Onozuka R-10，Yakult）+0.2%果胶酶（pectinase，Yakult）+1%离析酶（Macerozyme，R-10，Yakult）。（4）分离“过山香”原生质体的酶液:3.5%纤维素酶（Cellulase，Onozuka R-10，Yakult）+0.15%果胶酶（pectinase，Yakult）+1%离析酶（Macerozyme，R-10，Yakult）+15.2 g/L KCl+7.8 g/L CaCl2+11%甘露醇+100 mg/L MES。

1.2 试验方法

1.2.1 野生阿宽蕉原生质体的分离野生阿宽蕉ECS参考魏岳荣方法通过种子途径建立，初始接种量为1.5%，每隔15 d继代1次，培养温度27℃，悬浮暗培养，摇床转速110 r/min。

取悬浮培养继代后7 d的ECS经200μm的细胞筛过滤后，取0.5 mL PCV的ECS加入到10 mL酶液中进行酶解。酶采用酶溶解液（15.2 g/L KCl、7.8 g/L CaCl2、11%甘露醇、100 mg/L MES）进行溶解，pH 5.7，经直径0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。在50 r/min的摇床上，27℃，黑暗条件下酶解8 h。采用过滤离心法进行原生质体的洗涤和纯化，纯化后的原生质体，最后用电融合液洗涤2次，电融合液的组成为:11%甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2，然后将原生质体用电融合液调整密度为105个/mL备用。

1.2.2 “过山香”原生质体的分离“过山香”香蕉的胚性细胞悬浮系（ECS）由广东省农业科学院果树研究所通过多芽体途径建立[4]，参照肖望等的方法[5]分离“过山香”原生质体。纯化后的原生质体用电融合液洗涤2次，最后将原生质体用电融合液将密度调至105个/mL备用。

1.2.3 原生质体的融合将处理后的亲本原生质体按1∶1体积混合，取250μL原生质体混合液体小心地加入到电融合仪融合小室的底部，电融合仪为“Multiporator 4308（Eppendorf公司）”，融合室为250μL螺旋型铂金电极，电极间距为0.2 mm。将铂金电极小心地插入融合室中，缓慢旋紧使融合室不产生气泡，然后连接到共轴连接头上，静置10 min，选择设计融合参数，室温下进行电融合实验。

1.2.4 电融合参数的选择利用电融合仪平行单电极微型融合池（电极间距0.2 mm）进行“过山香”和野生阿宽蕉原生质体电融合参数的选择。将50 μL原生质体混合液均匀地加入到微型融合池中，在倒置显微镜下静置10 min后，观察原生质体成串情况，改变电极间的交流电场和电击时间使得大多数细胞成串为2～3个，施加直流脉冲电压，优化融合参数，使融合率和原生质体活力达到最佳值。在倒置显微镜下统计融合率，用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法进行原生质体活力检测。每个数据为5个视野的平均数，重复3次。融合率按以下公式计算:

1.2.5 融合产物的培养融合完毕后，静置20 min，将原生质体悬浮液从融合室内用移液体枪小心吸出置于1.5 mL离心管中，在800 r/min转速下离心5 min后去掉上清液，再添加1 mL原生质体培养基，在800 r/min转速下离心5 min，去掉上清液。最后用原生质体培养基调整原生质体密度为5×105个/mL。参考肖望等的方法[10]取其1 mL加入到看护培养基中，27℃，暗培养。

2 结果与分析

2.1 交流电场强度对原生质体串珠形成的影响

交流电压（AC）的强度以及作用时间直接影响到原生质体融合时的成串效果。将双亲原生质体按1∶1的比例混合后加入融合室中后，静置10 min，待大多数细胞沉降下来，使融合细胞处于同一层次，从而避免原生质体处于空间不同位置而不能成串。施加交变电压，细胞的成串效果是由AC强度及其作用时间共同决定的，AC强度过小、作用时间过短，使细胞不能紧密相邻，难以达到融合；AC强度过大和时间过长，一方面对细胞造成伤害，另一方面易形成多细胞融台体。表1结果显示:在电极距为0.2 mm的条件下，当AC增加到100 V时，原生质体开始有转动现象，但细胞很少有成串排列现象；当AC增加至150 V时，原生质体开始移动，并且沿电场方向形成平行排列的串珠；当AC增加至200 V时，串珠长度大约为2～3个/串；AC强度继续增加，则形成串珠的时间缩短，且串珠长度增加，原生质体开始有变形现象；此时继续加大AC强度，一部分原生质体被拉得很长而破裂。由此可见，调整AC强度和时间对提高香蕉原生质体理想细胞串有明显效果。试验表明，AC作用强度200 V/cm、作用时间30 s为香蕉原生质体融合的适宜交流电场强度。

表1 交流电场对原生质体串珠形成的影响

2.2 直流脉冲强度对原生质体融合的影响

直流脉冲（DC）强度是影响原生质体融合效率的一个重要因素。当大多数细胞成为2～3个串珠时，施加瞬时DC脉冲电压，细胞开始融合，施加的脉冲电压以细胞串振动和串珠刚刚断裂为标准，静置约20 min后融合体成为圆球体。表2结果显示直流脉冲强度对融合效率的影响，当DC强度为500 V/cm时，未能观察到原生质体融合；随着DC强度的增加，原生质体融合率逐渐升高，但细胞活力下降；当DC强度为1500 V/cm时，融合率达到最高，为32.4%；随着DC强度的继续加大，原生质体融合频率下降，部分串珠解体和部分原生质体破裂，还有部分原生质体失活，从而影响以后的培养效果。因此，确定DC强度1500 V/cm为香蕉原生质体融合的适宜脉冲强度。

表2 不同直流脉冲强度对融合率的影响

2.3 直流脉冲作用时间对原生质体融合的影响

在AC为200 V/cm，AC作用时间30 s，DC强度为1500 V/cm的条件下，研究了不同DC作用时间对原生质体融合率的影响，试验结果见表3。当DC作用时间为10μs时，没有融合的发生；当DC作用时间为40μs时，融合率达到32.7%，活力80.5%；当DC作用时间为50μs时，融合率达到最高，为34.9%，但此时原生质体活力下降到76.1%；DC作用时间为60μs时，融合率和原生质体的活力均下降。据此，确定最佳DC作用时间为50μs。

表3 不同直流脉冲作用时间对融合频率的影响

2.4 直流脉冲作用次数对原生质体融合的影响

在AC为200 V/cm，AC作用时间30 s，DC强度为1500 V/cm，DC作用时间为40μs的条件下，研究了不同DC作用次数对原生质体融合率的影响。从试验结果（表4）看出:脉冲次数对原生质体融合率和细胞活力具有一定的影响，当脉冲次数为1次时，融合率较低；脉冲次数为2次时，原生质体融合率和原生质体活力达到最大，分别为32.4%和81.4%；脉冲次数超过3次时，部分原生质体开始破裂，原生质体活力下降。因此，确定脉冲次数2次为理想脉冲次数。

表4 脉冲次数对原生质体融合率的影响

3 讨论与结论

细胞融合技术在植物育种上具有很大的意义，它既能克服种间杂交的不亲和性，又能在亲缘关系较远的植物之间转移染色体及细胞质，从而创造出新物种。电融合是通过适当强度的电脉冲处理使原生质体质膜发生可逆击穿而融合。它与PEG介导融合法相比，具有对细胞伤害小、易于观察等特点。虽然电融合原理已经清楚，但在实际操作中理想参数的确定受材料、融合仪及融合室类型的影响。如交变场强过大或脉冲强度过强均会造成原生质体破损，但若交变场强强度过小或脉冲强度不够，则融合效果不佳。在香蕉原生质体电融合过程中观测到不同层次上的原生质体在同一交流电场上的作用下的运动速度不同，成串时间也不同，并且不同层次上的原生质体由于空间位置关系不容易粘连。本试验将原生质体混合液静置10 min后，使原生质体全处于同一层次上再进行电融合参数的选择，从而确立最佳的电融合参数。本试验建立适合香蕉原生质体体细胞杂交的电融合参数体系是:在电融合液为11%甘露醇+0.1 mmol/L CaCl2的条件下，AC强度为200 V/cm，作用时间30 s时，原生质体两两紧密接触，成对效果好；对直流脉冲的研究发现，DC强度为1500 V/cm，作用时间40μs，脉冲次数2次时，原生质体融合的效率和活力达到最高值，分别为32.4%和81.4%。这一结果为香蕉体细胞杂交及再生培养研究提供了技术参考。

[1]Matsumoto K,Vilarinhos A D,Oka S.Somatic hybridization by electrofusion Of banana protoplasts[J].Euphytica,2002,125（3）:317-32.

[2]Assani A,Chabane D,Haicour R,et al.Protoplast fusion in banan（Musa spp.）:comparison of chemical（PEG:Polyethylene glycol）and electricalprocedure[J].Plant Cell Tiss.Org.Cult,2005,83（2）:145-151.

[3]Xiao Wang,Huang Xia,Gong Qing,et al.Somatic hybrids obtained by asymmetric protoplast fusion between Musa Silk cv.Guoshanxiang(AAB)and Musa acuminate cv.Mas（AA）[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2009,97（3）:313-321.

[4]魏岳荣，黄学林，黄霞，等.香蕉多芽体的诱导及其体细胞胚发生[J].园艺学报，2005，32:414-419.

[5]肖望，黄霞，魏岳荣.“过山香”香蕉原生质体培养及植株再生[J].园艺学报，2008，35（6）:873-878.