退色疟原虫血片标本的不同复染法比较

丑莉莉

退色疟原虫血片标本的不同复染法比较

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目的探讨已退色疟原虫血片复染的最佳方法。方法采用五种染色方法，用不同浓度的染液，不同的缓冲液及染色时间，进行对比实验。结果疟原虫血片标本用传统的单一染色法复染，效果均不佳。瑞氏与吉氏复合染色法，虫体结构清晰着色均匀。结论瑞氏与吉氏复合染色法复染退色疟原虫血片可满足教学重复利用。

疟原虫血片，退色，复染

疟原虫标本不易采集，而且长期保存的标本易退色。传统的单一染色法存在某种缺陷：瑞氏染液染色法具有方法简便，染色快速的优点，但保存的时间不长；吉氏染液染色法，不容易褪色，但细胞浆与中性颗粒着色较淡，颜色分辨不清楚。为使退色标本重复使用，满足教学实验课的要求，并制作出高质量的疟原虫标本，作者对退色的疟原虫标本进行复染，摸索出瑞氏与吉氏复合染色法复染方法，效果较佳。

1 材料

退色疟原虫血片，二甲苯，2%盐酸酒精，磷酸缓冲液，美蓝，吉氏染液，瑞氏染液，吉氏生理盐水染液，瑞氏-吉氏复合液。

2 方法

2.1 各种染液配制

按文献方法配制磷酸缓冲液、瑞氏染液、吉氏染液、吉氏生理盐水染液和瑞氏-吉氏复合液［1］。

2.2 疟原虫血片的退色

2.2.1 清除污垢

先选薄血膜较完整的退色疟原虫标本片，将血片放入盛有二甲苯的染色缸1～2d，使胶溶解，盖片脱落，然后取出血片，放入洁净二甲苯染色缸中蘸洗几次，用擦镜纸擦净，未加盖片的旧血片，可直接投入二甲苯中2～3h除垢即可。

2.2.2 退色

将除去污垢的血片垂直浸入盛有2%盐酸乙醇液的染色缸中，待血膜上原吉氏液颜色退净后，用自来水冲洗10min晾干备用。

2.3 疟原虫血片的复染

2.3.1 吉氏（Giemsa）染液染色法 分别用pH6.8，pH7.2的磷酸缓冲液配制2%，3%，5%，10%的吉氏染液，在室温约27℃下，将上述退色的血涂片分为十四组，用2%吉氏液分别染色30min、50min及1h,3%吉氏液分别染色30min和50min，5%、10%的吉氏染液各染色30min。用肉眼观察染色情况，至颜色合适后用缓冲液冲洗，晾干镜检，结果显示浓度为2%的吉氏染液染1h及3%吉氏染液染50min（缓冲液的pH为7.2）较其他各组好，但各期虫体形态特征及颜色对比仍不能完全满足教学，且有细胞粘连。而其他各组效果均不佳[2]。

2.3.2 吉氏（Giemsa）染液加美蓝染色法 在上述方法下加适量美蓝于吉氏染液中以复染旧片（即40ml吉氏染液原液加1g美蓝，摇匀）。加适量美蓝可使旧片血膜中颜色变淡的疟原虫胞质恢复原色，如此着色较佳。但染色时间不宜过长。结果显示此法复染血片效果不如单纯吉氏染液染色法。

2.3.3 吉氏生理盐水染液染色法 取吉氏原液5～7ml加0.85%生理盐水（中性的）至100ml，染色0.5～1h。此法可使白细胞及疟原虫着色更为鲜明，被寄生红细胞的薛氏点和门氏点亦更清晰。此法初染效果较好，但复染效果不佳。

2.3.4 瑞氏与吉氏复合染色 在室温约27℃下用瑞氏染液先染5～10min，然后用pH分别为6.8和7.2的吉氏原液、3%吉氏液、5%吉氏液、10%吉氏液各染10min，30min，50min。结果显示用pH为7.2的缓冲液，浓度为10%的吉氏染液染色30min后虫体形态结构清晰，效果较好，基本符合教学要求，缺点是颜色对比不非常鲜明。

2.3.5 瑞氏-吉氏复合液 在室温约27℃下，用瑞氏-吉氏复合液各染10min，20min及30min。结果显示：用此法染色20 min后各期虫体形态特征清楚，结构清晰，此时红细胞为浅红色，疟原虫胞浆为兰色，细胞核为红色，胞浆里的疟色素为棕褐色。适合教学实验使用。

3 结果

我们采用5种方法，通过不同浓度，不同时间及pH值染色效果对比，在室温约27℃下，用瑞氏-吉氏复合液染色20min效果较其他染色法效果好。由于瑞氏与吉氏复合染色实验所用的瑞氏染液偏于酸性，吉氏染液用pH7.0～7.2的缓冲液所稀释，略偏碱性，此时瑞氏染液和吉氏染液互相弥补了对细胞核和细胞质着色不足的缺陷，使虫体结构清晰，着色均匀，颜色鲜明，易于观察，适合教学实验使用。该方法可以进行大批染制。

4 体会

复染片必须洁净无油，而且血膜上原吉氏液颜色需完全退净。染色时应根据疟原虫采集、使用时间的长短，染液的质量和配置的新旧、染液的稀释度和进行染色时的气温高低选择染色时间。一般说来，以染液稀释的较淡，染色时间延长些，效果较为满意。稀释染液用的缓冲液以pH7.2为佳。如果染色过深，可以适当延长冲洗时间予以纠正。冲洗时宜将缓冲液滴加在复染片上，切忌先倾去染液，以免染液残渣粘附其上，影响观察。

［1］ 陈佩惠.人体寄生虫学检验技术［M］.北京：科学出版社，1988：217.

［2］ 王唯唯.疟原虫薄片标本退色后的复染效果［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2002 ，20（6）：324.

Objective To explore the best ways for redyeing biology specimen of plasmodium blood smear. Methods The plasmodium blood smears were redyed by fi ve different ways in different density, pH and time, Results Compared with traditional single dying method, compound staining of Wright-Giemsa was well done with plasmodium polypide pigmented and clear structure. Conclusion Compound staining of Wright-Giemsa can be carried out to perform teaching process satisfactorily.

Plasmodium blood smear;Fade; Redyeing

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.32.102

132011 北华大学医学检验学院（丑莉莉）