电阻抗法细菌药物敏感快速检测装置的研制

王洪志，庞小峰，王爱华

1 电子科技大学 生命科学与技术学院 生物电磁学与生物电子技术四川省重点实验室，成都市，610054 2 西南民族大学 生命科学与技术学院 生理实验室， 成都市，610041

电阻抗法细菌药物敏感快速检测装置的研制

【作 者】王洪志1.2，庞小峰1△，王爱华2

1 电子科技大学 生命科学与技术学院 生物电磁学与生物电子技术四川省重点实验室，成都市，610054 2 西南民族大学 生命科学与技术学院 生理实验室， 成都市，610041

报告利用细菌在生长繁殖过程中的代谢产物可使培养基电阻率降低的特性， 研制一种电阻抗法细菌药物敏感快速检测装置，该装置主要由微生物电阻抗传感器、计算机系统、信号发生器、电阻抗检测电路、时间程序分配控制器、恒温培养箱和辅助电路等组成。它可测量培养基电阻抗，并将细菌在培养期间内取得的阻抗值描记成阻抗曲线图，利用这种阻抗曲线的形态差别判断细菌的药物敏感性。该检测装置缩短了细菌药物敏感检测的时间，对实现医学临床快速药物敏感试验、药敏检测自动化和智能化有一定的实际意义。

阻抗法；细菌药物敏感；阻抗曲线；检测装置

近年来，人们感到用药剂量越来越大，新药的品种越来越多，但药物疗效反而不如以前。研究报告的资料证实，各种临床常见致病菌已对现有的多种抗菌药物产生了广泛的耐药性，选择有效的抗生素和药物治疗疾病，是临床医学迫切需要解决的问题[1]。随着临床微生物学的发展，对致病菌药物敏感性快速检测方法的自动化、智能化正日益引起国内外微生物工作者和生物医学工程工学者的重视。现已有十几种致病菌药物敏感性快速检测装置问世, 如气相色谱法、生物发光法、化学发光法、荧光免疫法、放射性同位素法、微热量法、浊度法和电阻抗法等等。这些测量方法原理各不相同，但其共同特点是自动化程度高, 检测时间短，可在1～10 小时内甚至几分钟内完成并出报告[2]。本文介绍一种电阻抗法细菌药物敏感快速检测装置。

1 检测装置

1.1检测装置组成

电阻抗法细菌药物敏感快速检测装置由微生物电阻抗传感器、恒温培养箱、信号发生器、电阻抗检测电路、时间程序分配控制器、计算机系统和实验废弃物处理单元等组成，如图1所示。

图1 检测装置原理框图Fig.1 Detector Block Diagram

1.2微生物电阻抗传感器

1.2.1 微生物电阻抗传感器结构

图2 微生物电阻抗传感器Fig.2 Microbial electrical impedance

将普通细菌培养皿改造，保留细菌培养功能，加装电极，制成微生物电阻抗传感器，如图2所示。该传感器由测量电极片、特制培养皿、胶盖、专用培养基和接线柱等组成。测量电极片镶嵌在两根绝缘棒中，长度30 mm，直径2.5 mm。绝缘棒固定在胶盖上，其上端有接线柱。测量电极和胶盖部分能耐高温消毒。特制培养皿容积约25 ml，是一次性使用，使用过后销毁。传感器的功能要求是能进行需氧和厌氧细菌培养检测。

使用时，先将液体培养基注入特制培养皿内，再挑取需要的细菌接种到液体培养基中，随即将测量电极放入其中，盖紧胶盖。如是厌氧菌培养还需封闭胶盖上的通气孔，后传感器插入培养箱插槽架中。最后将电线与胶盖上部的接线柱相连接。

1.2.2 微生物电阻抗传感器使用方法

① 细菌接种 按细菌接种的要求和操作规程[3]，首先将专用液体培养基（SM1H ）注入各传感器的特制培养皿内，挑取需要检测的菌种到专用液体培养基中。本实验分别挑取了纯培养的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌各约直径2 mm的一个菌落，将它们分别接种到专用液体培养基中。

② 细菌培养 将测量电极放入特制培养皿中，盖紧胶盖。如是厌氧细菌培养，还需封闭胶盖上的通气孔，再将微生物电阻抗传感器放入专用恒温培养箱中。然后，将箱内各连线接口按顺序分别与微生物电阻抗传感器上部的接口相连接，在37℃环境下连续培养。

③ 采集数据 细菌在微生物电阻抗传感器内培养期间，时间程序分配控制器每间隔5或10 min分别对每一个微生物电阻抗传感器顺序检测采集数据一次，直至培养结束。

④ 传感器用后处理 微生物电阻抗传感器在每次使用后，特制培养皿连同培养物在实验废弃物箱（干热箱）中灭菌消毁。测量电极要进行彻底的消毒杀菌后再用。

1.2.3 专用液体培养基的制备

筛选和配制专门适用于电阻抗测量要求的液体培养基。现已通过试验，筛选出了SM1H型和SM2H型两种液体培养基。

① SM1H型液体培养基基础配方

牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0 g，氯化钠0.5 g，蒸馏水100 mL，pH7.2～7.5。

② SM2H型液体培养基基础配方

蛋白胨10g，乳糖10g，伊红γ0.4g，美蓝0.065g，磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2g。

1.3其它装置

1.3.1 恒温培养箱,将普通恒温培养箱内部进行改造而成，内设5层传感器插槽架，可供安放传感器之用，每层可插30支，5层共可安放150个传感器。在培养箱顶部通气孔处，传感器测量电极片连线由此处汇集引出，如图3所示。

图3 培养箱内传感器和插槽架Fig.3 Incubator shelf sensors and slot

1.3.2 信号发生器，使用交流1 KHz恒流，作为测量电极的信号源。

1.3.3 时间程序分配控制器，可以分配交流信号源在规定时间按顺序将所有传感器检测，如5 min或10 min等。

1.3.4 信号放大器，作交流检测信号放大之用。

1.3.5 实验废弃物处理箱，实际是一个干热灭菌箱。微生物电阻抗传感器在每次使用后，特制培养皿连同培养物在实验废弃物处理箱中灭菌销毁。测量电极要进行彻底的消毒杀菌后再用。

1.4检测装置电气原理

电阻抗法细菌药物敏感性检测装置电气工作原理如图4所示。用时间程序分配控制器控制多路输入控制器的工作过程，如检测时间，信号宽度、时间间隔和测量次数等条件。检测时，信号发生器提供稳定的电流、电压和1 KHz信号，对微生物电阻抗传感器进行间歇测量。150个传感器安装在5层传感器插槽架上，同时顺序接受检测信号，所取得的培养基阻抗信号汇集在信号放大器进行放大，放大的信号进行A/D转换后输入计算机处理。通过专用软件处理，结果以图形显示及打印，给出检测报告。

图4 检测装置电气原理框图Fig.4 Block diagram of electrical test equipment

2 检测原理

2.1电阻抗法检测细菌原理

用电阻抗法检测细菌的原理是因细菌在生长繁殖过程中会将培养基中的糖、脂和蛋白质等营养物质，通过细菌的代谢活动，转变成各种胺类、丙酮酸、无机盐类、尿酸和各种有机酸成分等尾产物，使培养基中原来的化学成分发生了改变，尤其是各种盐离子的含量增加3～12倍[4]。生物电子学认为糖、脂和蛋白质等有机成分导电性较差，而胺类、丙酮酸、各种无机盐类和尿酸等导电性较好，这会使得培养基的导电性能大大的提高[5]。这意味随着细菌的生长繁殖，其培养基的电阻抗值会发生变化，电阻抗值逐渐降低。

2.2电阻抗法细菌药物敏感性检测原理

用阻抗曲线图判断细菌药物敏感性的原理，是将培养基分成接种细菌实验组、接种细菌对照组和不接种细菌对照组；接种细菌对照组因在培养基中未滴加任何抗菌素，细菌正常生长繁殖不受影响，其培养基电阻抗值降得最低，反映以时间为横坐标，以电导率值（S值）坐纵标的图上阻抗曲线上升最高；不接种细菌对照组因是培养基中未接种任何细菌，培养基内无细菌生长繁殖，培养基成分不发生改变，电阻抗值在这段时间内基本没有变化，所以其阻抗曲线基本没有上升，近似一条平行于X轴的直线；接种细菌实验组是滴加各种抗菌药物于培养基内，抗菌药物对细菌有杀抑作用会使电阻抗曲线形态不同于不接种细菌对照组和接种细菌对照组，它是介于它们之间的一种曲线。如果某种抗菌药物对细菌有很好的杀抑效果，说明细菌在其培养基中能几乎不能生长繁殖，其阻抗曲线应与不接种细菌对照组阻抗曲线形态相似并靠近，越靠近说明杀抑效果越好；如果抗菌药物无效，说明细菌在培养基中生长繁殖不受抑制，其形成的阻抗曲线与接种细菌对照组阻抗曲线形态相似并靠近，越靠近说明杀抑效果越差；如抗菌药物杀抑作用一般，说明细菌在其培养基中能部分或局部生长繁殖，其阻抗曲线是介于对照组和接种对照组之间的一种曲线。依此用这些阻抗曲线图的差别进行细菌药物敏感性判断[5.6]。

3 实验结果

3.1细菌特征阻抗曲线图

图5所示，是用该检测装置通过测量培养基电阻抗值的变化,描记出以时间为横坐标，以电导率值（S值）坐纵标的大肠杆菌、沙门氏菌，金黄葡萄球菌三种细菌特征阻抗曲线图[5]。

从图5中可以看出，接种大肠杆菌、沙门氏菌，金黄葡萄球菌3个培养基在培养期间所形成的曲线各不相同，其电导值（S值）都明显升高，这种升高与细菌在培养基内的生长繁殖有直接关系，但不同种类细菌的阻抗值所形成曲线形态是不相同的。这是因为不同种属细菌在相同的培养条件下，在单位时间内细菌的适应性和生长繁殖速度以及尾产物是不相同的，所以形成了各自不相同的阻抗曲线。对照组在培养6 h后，曲线基本是一条平行于X轴的直线，说明其培养基的阻抗值在这段间内基本没有变化，培养基内基本无细菌生长繁殖。在0～2 h内该曲线有上升，是由培养基的温度从室温升高至37℃时引起的。

图5 细菌特征阻抗曲线图Fig.5 The characteristic impedance curve of bacteria

3.2细菌药物敏感性检测图

在细菌特征阻抗曲线图的基础上，以金黄葡萄球菌药物敏感试验为例，用百虫杀、头孢菌素、氨卞青霉素、青霉素和庆大霉素5种抗菌药物进行药物敏感试验。图6是金黄葡萄球菌药物敏感杀抑阻抗曲线图。

图6 金黄葡萄球菌药物敏感杀抑阻抗曲线图Fig.6 Killed staphylococcus aureus sensitive to inhibition of drug resistance curve

比较5种抗菌药物杀抑细菌阻抗曲线可以看出，在4 h加药时间点后5种抗菌药物的阻抗曲线在纵坐标上的阻抗值都比未滴加抗菌药物的正常金黄葡萄球菌阻抗曲线低，但比对照组高；5种抗菌药物形成的5条曲线形态上也有明显差异。这说明5种抗菌药物均有不同程度的抑制或杀灭细菌的作用，其中百虫杀消毒剂对金黄葡萄球菌有最强的杀灭效果，曲线基本是一条直线，最靠近对照组；而另外4种药物杀抑效果则各不相同，庆大霉素和普通青霉素对金黄葡萄球菌的杀抑效果最差。5种抗菌药物对金黄葡萄球菌的杀抑效果排序如下。

百虫杀＞头孢菌素＞氨卞青霉素＞青霉素＞庆大霉素

4 讨论

我们研制的药物敏感试验检测装置样机, 可同时作10～50个细菌样品的药物敏感检测试验。几种药物同时作药物敏感检测，已作近百次, 重复性较好。同时，也可用于作细菌有无的检测和阻抗特征曲线区别少数菌种等工作。各种细菌药物敏感试验都可在4～8 h内得出试验结果。

传统的药物敏感性试验需时间约24～36 h[7]，而电阻抗法进行细菌药物敏感试验时间可缩短至4～8 h，显示出这种方法的优越性；一次能检测150个传感器，同时可作多个人次多种抗菌药物的药物敏感性试验，大大的提高了检测效率，为医生正确用药和快速救治病人提供了检测手段。

电阻抗法用于临床细菌药物敏感试验是新生事物，各国都刚刚开始, 有许多试验研究要做，还很不成熟。但用物理学方法或电子学方法替代传统的化学方法和生物方法是生物医学工程学的发展方向[8]。阻抗法因其装置构成简单, 操作方便, 便于用微机控制, 特别是因它具有可同时检测多个样品, 测定速度快和检测值不受死菌影响等优点, 所以它是大有发展前途的细菌快速自动检测方法。该种检测装置对实现医学临床快速药物敏感试验，药敏检测自动化和智能化有一定的实际意义。

[1] 周贵民, 张军民. 我国细菌药物敏感监测应注意的几个问题[J]. 中华检验医学杂志, 2004, 01(01): 44-46.

[2] 程知义, 周佳敏. 微生物快速诊检新技术[M]. 上海: 上海科学技术文献出版社, 1984.

[3] 范秀容, 李广武, 沈萍. 微生物学实验[M]. 北京: 高等教育出版社,第二版. 1989.

[4] 丘冠英. 生物物理学[M]. 武汉: 武汉大学出版社, 2000.

[5] 王洪志, 王爱华. 用阻抗测量法进行微生物研究的试验[J]. 西南民族学院(自然科学版), 1997, 24(4): 416-417.

[6] 王洪志，王爱华. 用阻抗法进行细菌耐药性试验[J]. 东南大学学报（自然科学版）, 2004, 34（2）:206-209.

[7] 邢玉斌, 索维江, 贾宁, 等. 细菌的消毒剂药物敏感[J]. 微生物通报, 2006, 44(03): 184-188.

[8] 王凯, 殷涌光. SPR生物传感器快速检测沙门氏菌研究初探[J]. 食品科技, 2007, 32（9）:192-195.

植入式人工肾

肾功能衰竭病人主要是通过血液透析与肾移植来延长生命的，前者患者每周需要透析3次，每次3小时至5小时，耗费大量的时间与经费；后者肾的供体来源不足。美国加州大学旧金山分校日前宣布可望用植入式人工肾来取代。植入式人工肾脏中包含有数千个微型过滤器和生物反应器，能过滤血液中的毒素，模拟真实肾脏的代谢功能和水平衡功能。

为实现在植入人体的目的，研究人员计划通特殊设计活体肾脏细胞生长的间隔，缩小设备体积，使用组织工程学的方法来培养肾小管细胞，以提供象健康肾脏一样所必备的其他功能。整个过程在人体的血液压力下即可运行，无需泵和任何电力供应。如果该技术得以实现，患者将过上正常的生活，无需服用任何免疫抑制药物。体外模拟试验已初步获得成功。

（本刊讯）

Rapid Detection Device of Bacteria Drug-sensitivity using Electrical Impedance Method

【Writers】Wang Hongzhi1.2, Pang Xiaofeng1△, Wang Aihua2
1 Biological Electro Magnetic and Bioelectronic Technological Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life science and Technology, Electron Scienti fi c and Technological University, Chengdu 610054, China 2 Physiology Laboratory, College of Life science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China

impedance; bacterial drug sensitivity; impedance curve; detection device

】Since the bacteria metabolites in the process of growth and reproduction of can lower the resistivity characteristics of the medium, the electrical impedance method can develop a rapid detection device of bacterial drug sensitivity. The device consists of micro-organisms impedance sensors, computer systems, signal generator, resistance Anti-detection circuit, the time allocation controller, constant temperature incubator and auxiliary circuits and other components. It measures the electrical impedance of the medium, and bacteria in the culture period to obtain the impedance value of the monitor into the impedance curve. Drug sensitivity of bacteria can be determined, using this form of differential impedance curve. This detection device signi fi cantly shortened the time of bacterial drug susceptibility testing, achieving rapid drug susceptibility testing of clinical medicine, drug susceptibility testing automation and intelligence.

1671-7104(2010)04-0326-04

2010-04-27

庞小峰，E-mail: xiaofang869@yahoo.cn.com

R318.6

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10.3969/j.isnn.1671-7104.2010.04.004

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