饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的检测研究

上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所 杨海锋 赵志辉 顾赛红 邢增涛

磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇是大豆磷脂中最重要的活性成分，其所占比重的高低，是衡量大豆磷脂品质优劣的一个重要标准（章慧芳和陆娅，2007）。随着大豆磷脂市场需求的不断扩大，经常发生大豆磷脂产品的贸易纠纷。广大生产企业和用户都希望对大豆磷脂中的有效成分磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇进行检验和检测。国内外研究报道的大豆磷脂的检测方法主要是定磷法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等（张颖颖等，2006；卜延刚等，2004）。定磷法需要消化、显色等过程，操作繁琐、耗时。薄层色谱法干扰因素多，灵敏度不高，显色后定量误差较大而主要用于定性分析。高效色相色谱法以其高速、高效、高灵敏度、系统封闭避免不饱和键氧化等优点，受到普遍关注（董晓渭等，2000；Mounts和Nash，1990）。然而由于研究者应用的前处理技术、检测方法都不相同（张德权等，2006；Rombaut等 ，2005；Singleton 和 Stikeleather，1995；Becart等，1990），即使都使用HPLC技术，但分离柱、填料、流动相也存在差异，缺乏一个统一的标准。而不同的前处理方法和检测技术会对检测结果产生一定的影响，因此迫切需要建立统一的饲料级大豆磷脂中主成分的检测方法。本研究探讨了应用高效液相色谱法同时检测饲料添加剂大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验中所用的大豆磷脂产品来自国内6个主要大豆磷脂厂商的6个不同批次的产品，因此所选样品具有广泛的代表性。

1.2 试剂及仪器 正己烷：色谱纯；异丙醇：色谱纯；冰乙酸：色谱纯；1%冰乙酸溶液：1 mL冰乙酸用色谱纯水定容到100 mL；磷脂酰胆碱（PC）：标准物质，纯度 ≥ 99%；磷脂酰乙醇胺（PE）：标准物质，纯度 ≥ 99%；磷脂酰肌醇（PI）：标准物质，纯度≥98%。高效液相色谱仪：配有四联泵、柱温箱、紫外检测器（206 nm）。所用的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇标样来源应与所测定的样品一致，如测定的样品为大豆磷脂时，上述三种标样应来源于大豆。

1.3 标准溶液配制 精确称取约20 mg磷脂酰胆碱、20 mg磷脂酰乙醇胺与10 mg磷脂酰肌醇，用正己烷∶异丙醇∶1%冰乙酸溶液为 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中摇匀，溶液中 PC、PE、PI浓度分别为 2、2 mg/mL 和 1 mg/mL。准确吸取此溶液 0.25、1.25、2.50、3.75 mL 和 5.0 mL，并用正己烷∶异丙醇∶1%冰乙酸溶液为 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液定容至5 mL，使溶液中磷脂酰胆碱的最终浓度为0.1～2.0 mg/mL、磷脂酰乙醇胺的最终浓度为0.1～2.0 mg/mL、磷脂酰肌醇的最终浓度为0.05～1.0 mg/mL。过0.45 μm孔径滤膜。低于-16℃保存备用，保存时注意容器口的密封。如标样为三氯甲烷或甲醇溶解的溶液，必须将其中的溶液用氮气吹干，再用流动相溶解定容。

1.4 试样制备 依据样品中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量，称取0.1～0.5 g（精确到0.0001 g）试样，用正己烷∶异丙醇∶1%冰乙酸溶液为 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容于 10 mL容量瓶中。于涡旋振荡器上涡旋振荡，混匀后，置超声波清洗器中超声30 min（期间每10 min取出混匀一次）。取少量试液于离心管中，以3600 r/min离心分离15 min，取2 mL上清液过0.45 μm孔径滤膜，制得试样待测液进行色谱测定。低于-16℃保存备用，保存时注意容器口密封。

1.5 液相色谱条件 硅胶柱：硅胶柱，长250 mm，内径 4.6 mm，粒度 5 μm，或相当者；柱温：30 ℃；流动相：正己烷∶异丙醇∶冰乙酸溶液为 8∶8∶1（V∶V∶V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：206 nm；进样体积：10 μL。

1.6 液相色谱测定 用高效液相色谱仪分别对标准品溶液和样品溶液进行检测，测定其色谱峰面积的响应值，进行定量计算。对同一样品至少进行两次测定。

2 结果与分析

2.1 方法重复性 结果见表1。由表1可见，本方法中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定结果的相对标准偏差均小于4%，因此应用本检测方法测定大豆磷脂中三种主成分含量有较好的精密度。

2.2 回收率 结果见表2。

对大豆磷脂样品进行添加回收试验，称取约100 mg大豆磷脂样品，用正己烷∶异丙醇∶1%冰乙酸溶液为 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容至10 mL，称取10 mg磷脂酰胆碱、10 mg磷脂酰乙醇胺、5 mg磷脂酰肌醇标样，用混合流动相溶液溶解并定容于5 mL容量瓶中。分别取1 mL样品溶液和1 mL的大豆磷脂标样溶液于5 mL容量瓶中定容，过0.45 μm膜，装入样品瓶内，待测，回收率计算公式如下：

表1 方法重复性试验

表2 样品的回收率

回收率=（测定值-试样中大豆磷脂含量）/添加大豆磷脂含量。

表2的测定结果表明，此方法中饲料级大豆磷脂三种主成分含量的回收率均在96%～103%，因此应用本检测方法测定大豆磷脂中三种主成分含量有较好的准确度。

2.3 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇同时测定 选用国内6个不同厂家生产的大豆磷脂产品，测定其磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量，三者总和见表3。《美国中央大豆公司磷脂指南》中大豆磷脂的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量分别约为16%、14%和9%，本试验结果与其基本相符。

表3 不同产品中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量总和的检测比较 %

3 结论

本实验中所采用的饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的高效液相色谱检测方法，检测结果稳定、精确、可靠、可操作性强，为国内饲料添加剂大豆磷脂产品中主要活性成分检测提供很好借鉴。

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