生地黄中梓醇纯化工艺优选

杨 菁， 刘 影， 白 剑， 樊 淼， 安 阳， 岳春丽

（辽宁医学院细胞生物学及新药开发重点试验室，辽宁锦州 121001）

生地黄中梓醇纯化工艺优选

杨 菁， 刘 影， 白 剑， 樊 淼， 安 阳， 岳春丽

（辽宁医学院细胞生物学及新药开发重点试验室，辽宁锦州 121001）

目的：探讨生地黄中梓醇的最佳纯化工艺。方法：采用高效液相色谱法检测梓醇含量。以梓醇含量为指标，比较不同型号的大孔树脂、活性炭对梓醇的分离效果，再对所含梓醇的部分应用不同的葡聚糖凝胶进行分离。结果：优选确定的工艺为：用15%活性炭对梓醇粗提物吸附后，活性炭用20%乙醇洗脱，将收集洗脱液浓缩后用葡聚糖凝胶G-15进行分离，所得产物中梓醇含量在85%以上。结论：优化确定的梓醇化化工艺简单可行。

生地黄；梓醇；G-15；HPLC

生地黄为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）的干燥块根，临床应用广泛，具有滋阴补血、生津的功效。环烯醚萜苷类是生地黄的主要活性部位，其中梓醇含量最高。现代研究证明梓醇具有降血糖［1］、保护缺血再灌注受损神经元［2］、抗癌［3］等药理活性。但梓醇化学性质不稳定，易受酸碱［4］等条件影响，这为梓醇的纯化增加了难度，本文在地黄中梓醇提取工艺条件优化的基础上［5］，应用活性炭及葡聚糖凝胶对地黄醇提取物进行分离，以期获得纯度较高的梓醇。

1 仪器与试药

LC-10 Avp高效液液相色谱仪，日本岛津公司生产。KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声波仪器公司生产。A240型电子天平，美国梅特勒公司生产。恒温水浴箱 ，北京市永光医疗仪器厂。生地黄，产自河南省武涉县西陶镇，按照2005年版《中国药典》一部地黄质量标准检验，符合规定。梓醇对照品，批号110808-200407，购于中国药品生物制品检定所。HC-767型活性炭，杭州木材有限公司活性炭公司。大孔树脂，天津南开化工厂生产；葡聚糖凝胶，美国GE公司。乙腈，美国Fish公司生产。其余试剂为国产分析纯。

2 试验方法

2.1 梓醇的含量测定［6］色谱柱：日本岛津VP-ODS柱，4.6 mm×150 mm；流动相：乙腈：0.1%磷酸（1∶99）；流速：0.9 mL/min；柱温：36℃ ；检测波长：214 nm。

对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的梓醇对照品5.0 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用。

供试品溶液的制备 取供试品适量，加水至5 mL，制备成每1 mL含梓醇浓度约为每0.5 mg的溶液，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.2 梓醇粗提物的制备［5］取生地黄500 g适当粉碎，加入12倍量95%乙醇，回流提取1 h，滤过，得滤液1；药渣中加入10倍量95%乙醇，回流提取1 h，滤过，得滤液2，合并两次滤液，减压浓缩至500 mL，过滤，得地黄醇提物备用。批号：C20080301、C20080302、C20080303，梓醇浓度分别为3.18、3.16、3.19 mg/mL。

2.3 梓醇的分离纯化

2.3.1 活性炭对梓醇的吸附 活性炭的预处理取活性炭粉末100 g置105℃烘箱内加热3 h。放至室温后备用。

活性炭的吸附能力计算 量取100 mL样品，向其中加入15 g粉末状活性炭，搅拌，静置2 h，滤过，收集滤液，高效液相分别检测滤液和活性炭吸附前药液中梓醇含量。结果见表1。

实验结果可知，活性炭对梓醇具有较强的吸附能力，平均吸附量为19.9 mg/g。

2.3.2 梓醇的洗脱 根据活性炭特点，选择不同浓度的乙醇及水对活性炭进行洗脱。

表1 活性炭的吸附量

取200 mL样品，向其中加入30 g活性炭，搅拌，静置2 h，滤过，收集活性炭阴干，用1 000 mL水、1 000 mL 10%乙醇、1 000 mL 20%乙醇、1 000 mL 40%乙醇、1 000 mL 95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩至体积为200 mL，薄层跟踪检测，实验结果见表2、表3。

表2 不同浓度乙醇对梓醇洗脱薄层结果

表3 活性炭洗脱后梓醇的纯度和收率

实验结果提示10%～20%乙醇洗脱效果较好，收率在80%左右，梓醇纯度约为45%，采用活性炭吸附可作为梓醇的粗分离手段。

2.3.3 梓醇的进一步分离纯化 由于活性炭洗脱液中梓醇含量在45%左右，需对其进一步纯化，参考相关文献，本实验选取3种型号的葡聚糖凝胶分别考察对梓醇的分离情况。

葡聚糖凝胶的预处理在室温条件下，分别将将100 g葡聚糖凝胶G-15、葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶LH20用5倍体积的纯化水溶胀4 h，漂洗3次去除破损的胶粒，加入适量的纯化水充分混匀将凝胶灌入玻璃色谱柱，静置，使其充分沉降后，用纯化水平衡后，打开活塞放出多于的水，使液面略高于胶面时关闭活塞，待上样，径高比为1∶8。

样品的制备 取生地黄醇提液100 mL，用活性炭吸附，先用水洗脱1 000 mL，再用20%乙醇分别洗脱2 000 mL，收集20%乙醇洗脱液，减压浓缩至100 mL备用。

样品的分离 取10 mL样品，分别缓慢加到葡聚糖凝胶G-15、葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶LH20凝胶柱中，打开活塞，当药液面接近胶面时加水洗脱，采用部分自动收集器进行收集，流速为0.5 mL/min，每10 min收集一管。薄层跟踪检测梓醇。

通过薄层跟踪对3种不同型号的葡聚糖凝胶对梓醇的分离效果进行比较，由试验结果可见葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶LH20对梓醇的分离效果不理想，而葡聚糖凝胶G-15能将梓醇与其他成分实现较好的分离。

2.3.4 梓醇分离纯化验证试验 根据以上试验结果，采用活性炭吸附、20%乙醇洗脱及G15分离的方法，对梓醇粗提物进行了分离纯化。实验结果见表4。

表4 重复性试验结果

从表4可见，工艺进行重复性试验结果收率能够达到50%以上，梓醇纯度能够达到85%。

3 讨论

本实验在前期实验获得的梓醇粗提物［5］的基础上，首先比较了梓醇的粗提物在不同型号分别对D101、AB-8、S-5、NKA-9 四种型号大孔树脂考察吸附量和分离效果，其中只有大孔树脂D101对梓醇的分离效果较好，吸附量在1.002 mg/g干树脂，但也不能充分分离梓醇与糖类。活性炭对梓醇的吸附量为19 mg/g，其吸附量大于大孔树脂，分离效果与大孔树脂相同。由于活性炭操作简单，因此选用活性炭对梓醇进行分离，梓醇的收率约为80%，纯度在45%左右。

活性碳处理后，选用不同型号的葡聚糖凝胶对梓醇进行分离，结果表明葡聚糖凝胶G-15分离效果好，收率高达50%以上，纯度能达到85%以上。

［1］万昌武，张雅丽，桂华珍，等，地黄不同方法提取物制剂降糖作用的实验研究［J］，贵州医药，2003，27（12）：1112-1113.

［2］李 杨，李丹清，包永明，等，梓醇对缺血再灌注受损伤神经元保护作用的研究［J］.中国现代医学杂志2005，15（10）：1454-1460.

［3］Pungitore C R，AyubM J，Borkowski E J，et al.Inhibition of Taq DNA polymerase by catalpol［J］.Cell Mol Biol，2004，50（6）：767.

［4］王宏洁，边宝林，杨 健.地黄中梓醇变化条件的探讨［J］.中国中药杂志，1997，22（7）：408.

［5］刘 影，杨 菁，黄 雷，等.正交实验法优选地黄中梓醇的提取工艺［J］.时珍国医国药，2009，20（1）：157-159.

［6］中国药典［S］.一部，2005：82.

R284.2

A

1001-1528（2010）03-0416-03

2009-04-14

辽宁省自然科学基金（20072202）；辽宁省教育厅资助课题（20060528）；辽宁省教育厅创新团队课题（2008T115）

杨 菁（1968－），男，副教授，博士，硕士生导师，从事脑血管疾病机制及相关药物研究。Tel：（0416）4673465 E-mail：jzyangjing@gmail.com