益髓颗粒对ITP小鼠脾脏Treg细胞及其相关因子影响的研究

吴晓勇 李冬云 陈信义 王瑞昙 岳明 程玥 张晓双 张恩户

CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是一群表型和功能特异的T细胞亚群，在维持机体自身免疫耐受中起重要作用，它具有免疫抑制和免疫无能的特性[1-3]。近年来研究发现，Treg细胞数量减少或功能缺失可导致自身免疫性疾病。近年来的研究发现，免疫性血小板减少性紫癜(immune th rombocy topenic purpura，ITP) 是一种自身免疫性疾病，其发病与免疫失调关系密切[4-7]。为探讨Treg细胞及TGF-β1与ITP的发病关系以及益髓颗粒对ITP的免疫调节机制，我们通过血清免疫法建立与人类发病机制类似的ITP动物模型，并以益髓颗粒进行干预，用流式细胞术和ELISA法分别检测ITP小鼠脾脏Treg细胞及血清TGF-β1的变化。

1 材料

1.1 动物 Balb/C小鼠，SPF级，体重为18～22克，8周龄，雌雄各半，共40只，购于第四军医大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(军)2007-007；豚鼠，3月龄，雌性，购于西安市长安区斗门实验动物养殖场，动物合格证号：SCXK(陕)2007-002；动物饲养和实验均在陕西中医学院SPF级动物实验室进行，许可证号：SYXK(陕)2007-006。

1.2 药物 益髓颗粒系北京中医药大学东直门医院制剂，由北京勃然制药有限公司代加工(京药制字Z20053081)；醋酸泼尼松片系浙江仙琚制药股份有限公司产品(5m g/片，国药准字H 33021207，批号：080202)。

1.3 试剂 Freund’s Com p lete Ad juvant(FCA) and Freund’s Incomp lete Ad juvant(FICA)，Sigm a 公司产品；辣根过氧化物酶标记重组蛋白A(Protein A/HRP)，北京博奥森生物技术有限公司产品；Mouse Regu latory T cell Stain ing K it(FITC an ti-m ouse CD4，PE anti-m ouse CD25 PECy5 an ti-m ouse Fox p3, PE-Cy5 Rat IgG2a isoty pe control，A ffinity purified anti-mouse CD16/32(Fc Block))，eBioscience 产品；ELISA K it for Mouse TGF-β1(批号：0810272)，上海西唐科技生物有限公司产品。

1.4 仪器 SCW-CJ型超净工作台，苏州宏瑞净化科技有限公司生产；3111型恒温培养箱，美国Form a公司产品；L-530离心机，湖南赛特湘仪离心机有限责任公司生产；702超低温冰箱，美国电热公司；FACSCalibur流式细胞仪，美国Becton Dicknson公司；ELX808IU酶标仪，美国Bio-TEK。

2 方法

2.1 GP-APS制备及效价测定 取Balb/C小鼠，5%戊巴比妥钠麻醉，眼球取全血，EDTA-Na2抗凝，离心分离血小板，调整血小板数至1×109/m l；取分离的血小板分别与等量FCA和FICA混合成油包水状做好抗原，取含FCA抗原1m l于0周注射于豚鼠足掌、背及皮下至少四点，取含FICA抗原1m l分别于l，2，4周注射于豚鼠足掌、背及腹部皮下，每次至少四点，第5周从豚鼠心脏取不抗凝全血，离心分离血清即为GP-APS，分装贮存于-20℃冰箱；ELISA法检测GP-APS效价，设阴性对照，用Protein A/HRP代替碱性磷酸酶-蛋白A酶标抗体，用酶标仪在490nm处测吸光度(OD值)，大于或等于阴性对照孔OD值2倍即为GP-APS阳性；将GP-APS从-20℃中取出，56℃水浴30m in，用等量Balb/C小鼠红细胞吸附两次，用生理盐水稀释成1:4浓度GP-APS待用。

2.2 建模与分组 40只Balb/C小鼠按外周血小板计数随机分为正常组、模型组、泼尼松治疗组及益髓颗粒治疗组，每组10只。正常组常规饲养，其余各组参考文献[8-11]造模方法并加以改进，隔日一次按100μl/20g腹腔注射1：4稀释的GP-APS，造模第8天开始各组均按0.2m l/10g体积灌胃，其中正常组、模型组灌服生理盐水，酸泼尼松组按0.0113mg/10g体重灌服溶解液；益髓颗粒治疗组按0.3g/10g体重灌服益髓颗粒稀释液；每日1次，连续8天。

2.3 观察指标与检测方法

2.3.1 脾Treg细胞 脱颈处死小鼠，无菌取脾，研磨，过200目筛网，用冷PBS 洗涤2次，1000r/m in离心10m in，RPM I1640重悬细胞，制备脾单细胞悬液为1×107/m l；取脾单细胞悬液100μl，加0.125μg FITC-CD4，0.06μgPE-CD25，4℃反应30m in，用预冷的染色缓冲液洗涤1次，加新配制的固定/破膜液1m l，旋涡混匀，4℃避光60m in，加2m l破膜液离心，弃上清2次，加Fc Block1μg/test，4℃避光15m in，加0.5μg PE-Cy5 Foxp3抗体，避光4℃孵育30m in，加2m l破膜工作液离心，弃上清2次，用适量的染色缓冲液重悬细胞，以CD4和SSC设门，FCM检测。

2.3.2 血清TGF-β1 ELISA法检测，96孔酶标板分设标准孔、空白孔、待测样品孔。(1)分别加标准品、样品稀释液、待测样品100μl，37℃120m in，洗板5次，甩干；(2)加生物素化的抗小鼠TGF-β1 100μl，37℃60m in，洗板同前；(3)加HRP标记的亲和素100μl，37℃30m in，洗板同前；(4)加底物工作液(TMB)100μl，37℃避光15m in，加终止液100μl，用酶标仪在450nm处测吸光值(OD值)。绘制标准曲线，所有样品孔OD值均减除空白孔值后计算TGF-β1含量。

3 结果

模型组Treg、TGF-β1水平明显降低，与正常组比差异显著，有统计学意义，泼尼松及益髓颗粒治疗Treg、TGF-β1水平较模型组有所提升，差异显著，有统计学意义，但Treg仍未达到正常水平，与正常组比仍存在差异，而TGF-β1与正常组比差异不明显，无统计学意义。检测结果见表1。

4 讨论

1995年Sakaguch i等发现在正常人和小鼠外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中有一亚群持续高表达IL-2受体α链(CD25)，并将其命名为CD4+CD25+Treg细胞[12]。该细胞是一种新型的免疫抑制细胞，在维持机体自身免疫耐受中起重要作用，具有免疫抑制和免疫无能的特性[1-3]，在经TCR介导的信号刺激活化后不仅能抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，还能抑制其免疫功能，且这种免疫抑制不具有MHC局限性，能够抑制同种型或同种异型T细胞的增殖[13-14]。Treg也可通过分泌至细胞外或表达于细胞表面的TGF-β发挥免疫抑制作用。TGF-β具有抑制抗原递呈细胞及拮抗效应性T细胞的功能，在Treg细胞介导的免疫耐受及Treg细胞的产生和增殖中发挥重要的作用[15-18]。有研究表明，多种自身免疫性疾病存在CD4+CD25+Treg细胞数量和功能上的异常[19-21]。有研究发现，ITP患者Treg细胞及相关细胞因子TGF-β1的水平显著低于缓解患者和健康志愿者，且其抑制功能也出现明显障碍，证实Treg细胞数量减少和功能缺陷可能为ITP免疫紊乱的机制之一[22-24]。

表1 益髓颗粒对ITP小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg、血清TGF-β1水平的影响(±s)

表1 益髓颗粒对ITP小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg、血清TGF-β1水平的影响(±s)

注：与正常组比，●P＞0.05，△P＜0.05，△△P＜0.001；与模型组比，★P＜0.05，★★P＜0.001。

组别 n CD4+CD25+Foxp3+Treg(%) TGF-β1(pg/m l)正常对照组 10 8.82±1.86 892.91±41.25模型对照组 9 5.14±1.50△△ 754.01±64.19△△泼尼松组 10 6.37±1.86△★ 839.63±74.33●★★益髓颗粒组 10 6.72±1.85△★ 867.70±83.17●★★

益髓颗粒由炙黄芪、党参、生熟地、当归等组成，具有“益气养阴，活血止血”功效，作为制剂已在医院应用20余年，对骨髓增生异常综合征(M yelodysp lastic Synd rom es，MDS)具有良好的治疗效果。其疗效机制是：对MDS患者免疫机制失调具有调节效能，故进行拓展用于ITP的临床治疗，其显示度在于：该药能提升血小板数、缓解巨核系病态造血[25-26]。本研究通过血清免疫法建立与人类发病机制类似ITP动物模型，并用益髓颗粒进行干预治疗，以证实该药物是否对ITP有免疫调节作用。研究结果发现，与正常组比较，模型组小鼠外周脾脏Treg细胞及血清TGF-β1水平明显低，具有统计学意义(P＜0.05)。经干预后发现，泼尼松、益髓颗粒治疗组Treg细胞及血清TGF-β1水平明显高于模型组，具有统计学意义。实验结果提示：ITP小鼠Treg细胞比例下降，由此导致细胞免疫抑制功能缺陷，自身反应性T细胞活化；同时，Treg细胞减少，抑制性细胞因子分泌水平下降，抑制功能进一步减弱，不能有效的发挥免疫抑制作用，导致激活的T淋巴细胞增多，辅助B细胞产生自身抗体，使血小板破坏增加。实验结果证实，益髓颗粒可提高ITP小鼠Treg细胞的比例及血清TGF-β1水平，推测其可能在调节免疫功能紊乱和治疗身免疫性疾病存在作用靶点。促进Treg细胞免疫抑制功能也许是其作用机制之一。

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