志贺样毒素Ⅱ型变异体对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8 IL-6和PGI2的影响

张 伟,索占伟,刘钟杰,穆 祥,范 开

(1.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;2.北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206)

志贺样毒素Ⅱ型变异体[1](SLT-Ⅱe)是猪水肿病大肠杆菌导致仔猪形成水肿病的主要致病因子。研究证明,SLT-Ⅱe能损伤小肠上皮细胞和血管内皮细胞[2],引起细胞分泌功能障碍,进而导致微血管舒缩和通透性发生变化,最终形成猪水肿病。本试验通过研究SLT-Ⅱe作用大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(MVECs)后,其培养上清液中 IL-8、IL-6和PGI2的浓度变化,以期从SLT-Ⅱe影响微血管内皮细胞分泌功能方面,探讨SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs的损伤机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 DMEM培养基(GIBICO公司,U.S.A批号:1348411),D-Hank′s干粉(Sigma公司),胎牛血清(奥地利 PAA Laboratories GmbH 批号:A04105-0180),氧化苦参碱(购自中国药品生物制品检定所),SLT-Ⅱe粗制品(蛋白含量为10 mg/mL)由扬州大学兽医学院微生物与免疫学教研室提供。鉴定试剂:兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清、羊抗兔IgG-FITC,均购自Sigma公司。550型酶标仪(BIO-RAD公司生产)。

1.2 大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的分离培养 选用出生24 h内的SD大鼠乳鼠,参照索占伟[3]等的肠黏膜微血管内皮细胞的培养方法,进行微血管内皮细胞的原代培养、纯化和传代培养。用免疫荧光法检测内皮细胞vWF因子相关抗原的方法对所培养的细胞进行鉴定。

1.3 试验细胞准备及处理 试验选用经过鉴定的第5代大鼠肠黏膜微血管内皮细胞。将呈80%融合状态的肠黏膜微血管内皮细胞以0.25%胰蛋白酶消化,细胞悬液接种到48孔细胞培养板,接种密度为 5×105/mL,每孔 250 μ L,置 5%CO2 培养箱中培养,待细胞融合成单层细胞时开始试验。

1.4 试验分组及指标测定 将培养的融合成单层细胞状态的大鼠肠黏膜MECs分为对照组和毒素组。每组设重复孔3个(其中PGI2测量组设5个重复孔),对照组加含5%血清的维持培养基,毒素组加含15.0 μ g/mL的SLT-Ⅱe的维持培养基,分别培养 3、6、9、12 h 后 ,收集细胞培养上清液,贮存于-20℃冰箱内待测。

1.5 细胞上清液中IL-8、IL-6和PGI2浓度测定

IL-8、IL-6和PGI2的浓度测定按照尚柏公司和USCN LIFE公司提供的 ELISA试剂盒的操作步骤进行。

2 结果

2.1 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs不同时间点分泌IL-8的影响 结果见表1。

表1 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-8的影响 pg/mL,n=3)

表1 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-8的影响 pg/mL,n=3)

与对照组比较,*:P＜0.05;**:P＜0.01;组内前后两个时间点相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

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由表1可以看出,对照组大鼠肠黏膜MVECs在第3、6小时和12小时均有IL-8分泌,且在第6、9小时和12小时的分泌量与第3小时相比,差异极显著(P＜0.01),说明IL-8是大鼠肠黏膜MVECs分泌的细胞因子之一,其分泌量随着培养时间的延长和细胞增殖引发细胞数量上升而增加。

毒素组大鼠肠黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第3、6、9小时和12小时,IL-8的分泌量均较相应时间点对照组有显著升高,说明SLT-Ⅱe有刺激大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-8的作用。另外,SLT-Ⅱe组4个时间点的IL-8的分泌量相比,后一时间点IL-8的分泌量均显著高于前一时间点,说明在12 h内,SLT-Ⅱe具有持续刺激大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-8的作用。

2.2 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-6的影响 结果见表2。

表2 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜 MVECs分泌IL-6的影响 pg/mL,n=3)

表2 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜 MVECs分泌IL-6的影响 pg/mL,n=3)

与对照组比较,*:P＜0.05;**:P＜0.01;组内前后两个时间点相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

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由表2可以看出,对照组大鼠肠黏膜MVECs在第3、6、9小时和 12小时均有 IL-6分泌,且相邻两个时间点的分泌量相比,后者显著高于前者,说明IL-6是大鼠肠黏膜MVECs分泌的细胞因子之一,其分泌量随着培养时间的延长和细胞增殖引发细胞数量上升而增加。

毒素组大鼠肠黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第3、6、9小时和12小时,IL-6的分泌量均较相应时间点对照组有显著升高,说明SLT-Ⅱe有刺激大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-6的作用。

2.3 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs分泌PGI2的影响 结果见表3。

表3 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜 MVECs分泌PGI2的影响 pg/mL,n=5)

表3 SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜 MVECs分泌PGI2的影响 pg/mL,n=5)

与对照组比较,*:P＜0.05;**:P＜0.01;组内前后两个时间点相比;△:P＜0.05,△△:P＜0.01

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由表3可以看出,对照组大鼠肠黏膜MVECs在各时间点均有PGI2分泌,前后两个时间点的PGI2分泌量相比,差异不显著,说明PGI2是大鼠肠黏膜MVECs分泌的细胞因子之一,其分泌量在12 h内处于平稳状态。

毒素组大鼠肠黏膜MVECs在SLT-Ⅱe作用后的第 3、6、9 h和12 h,PGI2分泌量均较对照组有显著升高,说明 SLT-Ⅱe有刺激大鼠肠黏膜MVECs分泌PGI2的作用。

3 讨论

IL-8主要由单核细胞、吞噬细胞和内皮细胞等产生,参与趋化和激活嗜中性粒细胞、T细胞等炎性细胞,促进释放生物活性物质,增强炎症反应和免疫反应[4]。IL-6是1980年用Poly I-C刺激成纤维细胞产生的一种能抑制病毒复制的细胞因子,主要由T细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞等产生,具有刺激多种细胞增殖,促进细胞分化,加速肝细胞急性期蛋白的合成等作用,参与多种炎症反应过程。

本试验研究证实,对照组大鼠肠黏膜MVECs在各时间点均有IL-6和IL-8分泌,证实大鼠肠黏膜MVECs是IL-6和IL-8分泌的细胞因子。有研究证实,IL-6和IL-8具有刺激细胞增殖作用[5]。从本试验结果可以看出,对照组的IL-6和IL-8浓度均随时间延长而上升,其中IL-6分泌量均显著高于前时间点,第6、9小时和第12小时的IL-8分泌量显著高于同组第6小时时,说明MVECs分泌的IL-6和 IL-8可能作用自身,引起MVECs增殖,最后引起分泌量上升。

大量研究资料证实,IL-6和IL-8与炎症的发生具有一定的关系[6]。IL-8参与趋化和激活嗜中性粒细胞、T细胞等炎性细胞,IL-6能刺激巨噬细胞等炎性细胞分化,释放生物活性物质,增强炎症反应。从本试验结果可以看出,毒素组各时间点的IL-6和IL-8浓度均显著高于对照组,说明SLT-Ⅱe能促刺激大鼠肠黏膜MVECs分泌IL-6和IL-8,有增强炎症反应作用。研究资料证实,在水肿形成过程中,主要原因可能是SLT-Ⅱe损伤微血管内皮细胞,但是微血管损伤与形成水肿之间的确切作用机制尚未弄清。本试验结果研究发现,SLT-Ⅱe能刺激大鼠肠黏膜MVECs显著增加对IL-6和IL-8的分泌,说明SLT-Ⅱe损伤血管内皮细胞,引起其对IL-6和IL-8的分泌增加,加重炎症反应进程,导致血管通透性发生改变,这可能就是SLT-Ⅱe引发猪水肿病的机制之一。

PGI2是强烈的血管平滑肌舒张剂,能扩张血管,抑制血小板聚集,在血栓形成和改变血管通透性方面具有重要作用。从本试验结果可以看出,对照组大鼠肠黏膜MVECs在各时间点均有PGI2分泌,说明PGI2是大鼠肠黏膜MVECs分泌的细胞因子之一,其分泌量在12 h内处于平稳状态。SLT-Ⅱe在引发水肿过程中,有血管通透性增加现象,但有关通透性形成的确切机制尚在研究中。从本试验结果可以看出,毒素组各时间点PGI2分泌量均显著高于对照组,说明SLT-Ⅱe具有刺激血管内皮细胞分泌PGI2的作用,恰好说明SLT-Ⅱe能引起微血管舒张,微血管通透性上升,这可能就是SLT-Ⅱe的致病机理之一。

综上所述,SLT-Ⅱe能刺激微血管内皮细胞对IL-8和IL-6的分泌增加,刺激相应炎性细胞增殖,促进释放炎性物质,加重炎症反应,改变微血管通透性,进而形成水肿,这可能是SLT-Ⅱe的致病机理之一;PGI2的分泌增加,其维持微血管正常舒缩的功能失调,导致血管通透性发生改变,进而引起水肿,这可能是SLT-Ⅱe的另一致病机制。

[1]Kausche F M,Dean E A,A rp L H,et al.An experimental model for subclinical edema disease(Escherichia coli entertoxemia)manifest as vascular necrosis in pigs[J].Am J Vet Res,1992,53(3):281-287.

[2]Waddell T E,Coomber B L,Gy les C L.Localization of potential binding sites for the edema disease verotoxin(VT 2e)in pigs[J].Canadian Journal of Veterinary Research,1998,62(2):81-86.

[3]索占伟,穆祥,许剑琴,等.犬鼠肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养[J].解剖学报,2005,36(2):214-217.

[4]邹敏君,刘肖珩,李毅,等.IL-8诱导血管内皮细胞迁移的实验研究[J].生物医学工程学杂志,2006;23(5):1013-1016.

[5]Koch A E,Polverini P J,Kunkel S L,et al.Interleuk in-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis[J].Science,1992,258(5089):1798-1801.

[6]朱金水,朱励,余小虎,等.氧化苦参碱对肝纤维患者IL-6、IL-8、IL-10水平影响[J].中国免疫学杂志,2003,19(3):191-192.