溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相体系分配行为的研究

近年来，由于双水相萃取技术在微生物、有机化合物等的分离和纯化、预浓集过程中表现出相当好的性能，并有望用于大规模提取和纯化生物活性物质，因此越来越受到人们的关注和重视[1～5]。我国粤西地区盛产的中草药溪黄草，性味苦凉,具有清肝热、利湿毒、明双目、健脾活血和抗癌等功效，临床可用于治疗肝胆湿热、脾失健运所致的胁胀疼痛、食欲不振等症,对眼赤目痛、肠胃消化不良亦有较好疗效。溪黄草主要含有黄酮类化合物、二萜化合物等[6,7]。

作者在此研究了溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相体系的分配行为，探讨了聚乙二醇和磷酸钠的用量、温度、溪黄草黄酮浓度等对双水相及萃取率的影响，为黄酮类化合物的提纯和富集提供了一些有意义的信息。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

溪黄草，购于茂名市医药公司。

聚乙二醇4000、磷酸钠、结晶氯化铝、 无水乙酸钠、 乙醇(95%)等，均为分析纯。

WFZ-26A型紫外分光光度计，天津市光学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 溪黄草黄酮提取液的制备[8]

称取一定量干燥的溪黄草粉末,在索氏抽提器中用石油醚脱脂至无色,冷却后蒸出石油醚,加入一定量的75%乙醇抽提至无色，即得溪黄草黄酮提取液。将提取液全部移至100 mL容量瓶，备用。

1.2.2 样品溶液的制备

取溪黄草黄酮提取液5 mL于50 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液和7.5 mL 1 mol·L-1NaAc溶液，用75%乙醇稀释至刻度，即得样品溶液。

1.2.3 双水相的配制

称取一定量的磷酸钠于比色管中，加入15 mL 0.05 mol·L-1PEG4000水溶液，在一定的温度下溶解静置，形成双水相。

1.2.4 分配行为的研究

用移液管移取3 mL样品溶液加入到聚乙二醇/磷酸钠双水相体系中，搅拌均匀，静置分层，待分配达平衡后，分别吸取上下相溶液,用紫外分光光度计测定其在420 nm的吸光度[9]。根据吸光度的比值,按下式计算溪黄草黄酮在双水相体系中的分配系数(K)和溪黄草黄酮的萃取率(Y)。

R=VU/VL

K=cU/cL

Y=cUVU/(cUVU+cLVL)

式中：R为相体积比；VU、VL分别为上下相体积；cU、cL分别为溪黄草黄酮在上下相的浓度。

2 结果与讨论

2.1 质量配比(mPEG/mNa3PO4)对双水相萃取溪黄草黄酮的影响(表1)

表1 质量配比(mPEG/mNa3PO4)对溪黄草黄酮萃取的影响

由表1可以看出：

(1)在一定温度下，溪黄草黄酮的分配系数K均大于1。这是因为溪黄草黄酮是具有α-或β-苯基苯稠吡喃酮的强疏水性物质，由于“相似相溶原理”，它较多地分配在富含PEG4000的强疏水性上相中[10],因此其K大于1。

(2)随着磷酸钠相对含量的增加(即mPEG/mNa3PO4的减小)，相体积比R逐渐下降，这和文献[10]、[11]结论一致。这是因为强电解质磷酸钠在水中离解为正负离子之后，由于有较强的形成水合离子的能力，从而部分夺取因“范德华引力”受聚乙二醇的醚键氧束缚的水分子之故。

(3)在一定温度下，溪黄草黄酮的分配系数K基本上随着磷酸钠相对含量的增加而上升。这与文献[12]结论一致。这是由于磷酸钠的盐析作用部分夺取聚乙二醇的醚键氧的“束缚水”之后，使得聚乙二醇分子排列更为整齐和紧密，熵值减少，疏水性更强，更有利于溪黄草黄酮分配之故。70℃时的某些反常情况，可能与接近双水相分相“浑浊点”80℃有关[12]。

(4) 溪黄草黄酮萃取率Y随着磷酸钠相对含量的减少(即mPEG/mNa3PO4的增加)而上升，这是相体积比R逐渐增大和溪黄草黄酮分配系数K逐渐减小的综合效应，由此可见，R增大的效应占优。

2.2 温度对双水相萃取溪黄草黄酮的影响(表2)

表2 温度对溪黄草黄酮萃取的影响

由表2可以看出：

(1)在相同mPEG/mNa3PO4和溪黄草黄酮浓度下，相体积比R随着温度的升高而下降。这主要是因为温度升高时,PEG在水中的溶解度增加， PEG分子部分转移到富含水的下相，导致上相体积减小、下相体积增大。

(2)溪黄草黄酮的分配系数K在mPEG/mNa3PO4≤1.50时，随温度的升高而下降；而在mPEG/mNa3PO4≥2.50时，却随温度的升高而上升。这是因为温度升高时，体系粘度减小，扩散系数增大，由浓度差所推动的“扩散作用”增强，溪黄草黄酮在上下相的浓度趋于相等，导致K降低而趋于1；另一方面，温度升高，分子的热运动加剧，溪黄草黄酮脱离亲水性强的下相而进入疏水性强的上相概率增加，同时PEG醚键氧束缚水的能力下降，疏水作用更强，导致溪黄草黄酮在上相的浓度增加，K升高。质量配比不同时的分配系数变化规律是两方面作用综合的结果。

(3)在mPEG/mNa3PO4≤1.50时，萃取率Y随温度的升高显著降低，这是相体积比R和分配系数K都下降的加合效应的结果；而在mPEG/mNa3PO4≥2.50时，温度升高萃取率Y变化很小，这是相体积比R下降和分配系数K上升的相消效应的结果。

2.3 溪黄草黄酮浓度对溪黄草黄酮萃取的影响(表3)

表3 溪黄草黄酮浓度对溪黄草黄酮萃取的影响

由表3可以看出：

(1)在相同mPEG/mNa3PO4和温度下，随着溪黄草黄酮浓度的升高，相体积比R逐渐下降。这是由于溪黄草黄酮是强疏水性的物质，有较强的吸附、加溶或排布在非离子型表面活性剂PEG周围区域的趋势，以促进Gibbs自由能降低、体系稳定。溪黄草黄酮的加入，必然会改变或破坏上相PEG的较为有序的状态，使上相物质相互之间的疏水作用、加溶作用、静电作用等发生了改变,部分PEG转入下相,从而导致上相体积减小、下相体积增大[2]。

(2)在相同mPEG/mNa3PO4和温度下，分配系数K基本是一个常量，差别最大是在mPEG/mNa3PO4=3.00、T=70℃时，其△K/K= 7.3%。这一结果符合Bronsted所提出的统计势力学公式[13]。

(3)在mPEG/mNa3PO4较大、温度较高的条件下，溪黄草黄酮萃取率较高，如在mPEG/mNa3PO4为 3.00、温度为60℃时，平均萃取率为76.69%。

3 结论

利用分光光度法研究了溪黄草黄酮在聚乙二醇/磷酸钠双水相体系的分配行为。结果表明，在一定的温度和溪黄草黄酮浓度下，随着mPEG/mNa3PO4的增大，萃取率上升；在一定的质量配比和浓度下，当mPEG/mNa3PO4≤1.50时，萃取率随温度的升高显著降低；当mPEG/mNa3PO4≥2.50时，萃取率基本保持不变；在一定的质量配比和温度下，溪黄草黄酮浓度对分配系数K(cU/cL)和萃取率基本没有影响。在mPEG/mNa3PO4=3.00、T=60℃时，平均萃取率可达76.69%。

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