一种新的微卫星PAGE的DNA显带方法

刘梦培，田 敏，傅大立，傅建敏，王彩霞

（1.中国林科院经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.中国林科院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）

微卫星DNA又称简单序列重复（simple sequence repeats，SSR)，是由1～6个碱基多次串联重复组成的核苷酸序列，在基因组间广泛分布，具有共显性、重复性好、多态性高、扩增结果稳定、检测手段简便易行等优点[1]，已成功应用在物种的遗传多样性（genetic diversity）[2－3]、遗传图谱构建（genetic mapping）[4－5]、系谱分析（Pedigree analysis）[6－7]、遗传育种（Genetics and Breeding）[8－9]等方面。

微卫星DNA条带的鉴别常采用聚丙烯酰胺凝 胶 电 泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）银染法，PAGE由Raymends和Weintraub在1959年创建，具有不易扩散、灵敏度高、分辨率高等优点[10]。银染技术是其常用的显影方法，如Bassam银染法[11]、Sanguinetti银染法以及在其基础上改良的一系列银染法。银染法的缺陷是步骤繁琐、耗时长、背景模糊、条带不清等，极易造成DNA条带错判，从而产生分析误差。许多研究者针对这些问题做了大量研究，但不能从根本上解决问题。本研究提出了微卫星PAGE的荧光染料显影法，试图从一个新的思路解决PAGE显带的问题。

1 材料和方法

1.1 材料

杏属不同品种幼嫩叶片；SSR引物UDP98-405，正向引物序列：5′-ACGTGATGAACTGACACCCA-3′，反向引物序列：5′-CCTACCGTCTCGTTTCT GAG-3′；GelRed核酸荧光染料。

1.2 PCR反应体系和程序

PCR反应体系总体积20μL，其中10×PCR Buffer 2.0μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、10 mmol/L dNTPs MiX 0.4μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O 14.6μL。PCR反 应 在Bio-Rad C1000T M Thermal Cycler型号的扩增仪上进行。ISSR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。试验于中国林科院亚热带林业研究所植物细胞工程实验室内完成。

1.3 琼脂糖凝胶电泳显带

PCR产物在浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上分离；核酸荧光染料为GelRed，采用前染的方法，将GelRed核酸荧光染料加到溴酚蓝上样缓冲液中。……