人CXCR3基因转染细胞株的构建、鉴定及初步功能研究①

孙 杰 刘玉华 陈永井 郭静雅 陈昌友 胡玲玲 陈明心 杜阳阳 徐耀瑜 邱玉华

(苏州大学医学部免疫学系,苏州 215123)

CXCR3(CD183)-CXC Chemokine Receptor 3是一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体,基因定位于X染色体q13区,编码区长度为1 104 bp,由368个氨基酸组成,分子量为40.659 kD[1,2]。目前已发现三种可变异构体 CXCR3-A、CXCR3-B、CXCR3-alt,通常所说的CXCR3是指CXCR3-A;有三种配体Mig、IP-10及I-TAC可与之结合[3]。在正常生理状态下,CXCR3主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞、巨噬细胞等。在一些疾病病理性进程中如自身免疫性疾病、移植排异、感染等病人外周血淋巴细胞表面呈高表达,在某些恶性肿瘤细胞表面也呈高表达[4-8]。研究表明,CXCR3介导的信号在指导白细胞定向迁移的同时,在肿瘤转移、自身免疫性疾病和移植排异等疾病的发生、发展和预后过程中发挥重要作用。通过免疫干预手段阻断CXCR3信号转导对上述疾病具有积极的治疗作用[9]。本研究旨在构建稳定表达人CXCR3分子的基因转染细胞株L929-CXCR3及在配体作用下的迁移效应,为进一步研制CXCR3单克隆抗体及功能研究奠定了物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料 LipofectamineTM2000、Zeocin和Top10大肠杆菌购自Invitrogen公司;各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、克隆载体pMD19-T及逆转录试剂盒购自Takara公司;琼脂糖粉购自上海华美公司;小量质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购自上海华舜公司;胎牛血清(FCS)购自Hyclone公司;TRIzol和RPMI1640培养基购自GIBCO公司;PE标记的鼠抗人CXCR3 mAb购自BD公司;24孔Transwell板购自Millipore公司。Mig、IP-10及 I-TAC购自 Peprotech公司;293T、L929细胞购自ATCC,由本室保存;逆转录病毒载体pEGZ-term及两个辅助病毒载体pHIT456和pHIT60由德国Sefling教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 人CXCR3基因的克隆与鉴定 根据GeneBank收录的人CXCR3基因序列(NM-001504)设计PCR引物,由南京金斯特生物技术有限公司合成。……