重组人促甲状腺激素β亚基的切胶纯化及多克隆抗体制备①

李敬华 柳明波 马 彦 左爱军 孙 蓓 梁东春 郭 刚

(天津医科大学代谢病医院/内分泌研究所,卫生部及天津市激素与发育重点实验室,天津 300070)

目前国内科研及检测所需抗hTSH抗体主要依赖于国外公司生产,严重制约了国内科研及相关工作的开展。本室自行构建了hTSH β链的原核表达系统,表达了重组GST-hTSHβ融合蛋白,进一步纯化后可做为免疫原来制备抗hTSH β链的抗体。由于大分子重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时易于形成包涵体。虽然易于将包涵体与可溶性蛋白分开,但自包涵体中溶解出目的蛋白则需经过洗涤、溶解、复性和透析脱盐等多步,在这个过程中易造成蛋白变性、浓度降低,致使动物免疫时不能保持足够的抗原性和浓度要求。本实验用切胶纯化法纯化了GST-hTSHβ重组蛋白,并运用该蛋白免疫了新西兰大耳朵白家兔,成功制备了相应的高效价抗血清。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂 含有pGEX-3X/hTSHβ重组质粒的E.coli DH5α菌株由本室构建及保存[1];BCA蛋白浓度测定试剂盒,免疫佐剂氢氧化铝购自美国Pierce公司;雄性新西兰大耳朵白家兔购自北京维通利华实验动物有限公司,人促甲状腺激素(hTSH)购自美国Sigma公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。蛋白胨、酵母粉均为Sigma分装。

1.1.2 器材 ∑960型全自动酶标测定仪(美国Metertech公司);96孔酶标板(丹麦Nunc公司);电泳仪(PowerPacTMHC,Power Supply BIO-RAD);垂直电泳槽(Mini-PROTEAN 3,Cell BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 重组GST-hTSHβ在 E.coli DH5α中的诱导表达 将-80℃保存的含有 pGEX-3X/hTSHβ的 E.coli DH5α菌株复苏后,挑取单菌落接种于含有100 mg/L氨苄青霉素的……