油松天然群体种子、球果形态及同功酶遗传变异研究

陈海龙,贾爱萍

(山西省林木良种培育中心,山西 襄汾 041500)

油松天然群体种子、球果形态及同功酶遗传变异研究

陈海龙,贾爱萍

(山西省林木良种培育中心,山西 襄汾 041500)

对5种油松天然群体同功酶的研究表明:1)5种群体在GO T,ADH,SDH,M DH的分析中均有不同的谱带表现;在M E分析中所有的单株中均有 1条清晰的谱带,属于 1个染色区,受 1个位点控制,该位点只有 1个等位基因,属单态位点。2)5种群体在7个位点的等位基因频率和平均期望杂合度在不同酶位点间存在着较大的异质性。3)群体间的遗传分化主要来自群体内个体间,平均占总群体的95.02%。

油松;天然群体;同功酶

油松是我国主要的乡土树种,分布范围广,遗传变异大,具有很大的遗传改良潜力,开展油松遗传变异研究具有十分重要的意义。本项研究对山西省文水县三道川林场的 5种油松天然群体在形态和分子水平上的变异和分化进行分析,研究和评价遗传多样性状况,为当地油松的遗传改良提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 研究材料

试验所用材料采自山西省文水县三道川林场。选取生长良好,林相整齐,无病虫害的 5种油松天然林分(见表1),每种林分选出 10棵单株作为样木,样木间距25 m以上。

表1 不同林分地理位置

1.2 研究方法

1.2.1 形态特征的测量

1)油松针叶长的测量:针叶采自树冠上部 1/3处,分单株带回。取每株样木的针叶33束,分别测量其长度,每10个测量值作平均进行统计分析。

2)油松球果大小的测量:球果采自树冠中上部东、南、西、北 4个方位,每个方位采 5个,每株共采20个,测量其长、宽,每株样木重复 8次。

3)油松种子百粒重的测量:将测量后的油松球果放于太阳下暴晒,得到单株种子。随机抽取100粒种子称重,重复 3次,取平均值,得到各单株的种子百粒重。

1.2.2 同功酶试验

1)酶液的制备。在各群体的每个单株上取自由授粉种子 30粒,用水冲洗干净后,置于 25°C温水中浸泡 2 d,然后在湿润滤纸上继续培养 3 d～ 5 d,至种子露白时,剥取每粒种子的单倍体胚乳,放入指形管中,加入1 mL样品提取液 (pH值7.6,0.2 mol/L的磷酸缓冲液),在冰浴中研磨成匀浆,倒入离心管,再将 1 mL 40%的蔗糖溶液冲入离心管,冷冻离心(0°C,10 000 r/min)10 min,然后取上清液,将其置于 (0°C～ 4°C)冰箱内 ,贮存备用。

2)凝胶的制备。按表2的比例制备分离胶和浓缩胶。分离胶的浓度是 10%,制备20 mL;浓缩胶的浓度是 4%,制备 5 m L。

表2 凝胶的制备

3)电泳。采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法。4种酶的缓冲系统见表3。用100 V电压预电泳 1 h,再用250 V电压继续电泳 3.0 h～3.5 h。待溴酚兰指示剂移至液面 1 cm时,停止电泳,准备剥胶染色。

4)染色。谷草转氨酶:称取 0.073g α-酮戊二酸,0.267 5 g天冬酸,1.0 g PVP,0.1 g EDTA和2.84 g Na2HPO4溶于少量蒸馏水中,定容至200 mL,配制成 GOT底物溶液。称取 0.05 g固蓝 BB溶于50 m L GOT底物溶液,即为染色液。将凝胶取出放入染色缸,倒入染色液,黑暗中37°C温育胶,直到呈现棕色的酶活性区带。

表 3 4种酶缓冲系统

乙醇脱氢酶:称取 NAD 15 mg,NBT 15 mg,PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)2.5 mg,量取 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液50 mL,混匀作为染色液。染色前,加 5 mL 95%乙醇作底物。电泳后剥下的凝胶板放在染色液中,37°C温至显现深蓝色的条带时,停止染色,倒掉染色液,用蒸馏水冲洗,拍照记录。

山梨醇脱氢酶:称取150 mg山梨醇,溶于 30 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中,10 mg NAD,10 mg M TT和 5 mg PMS溶于 20 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中 ,量取 1.0 mL 1% MgCl2,将3种溶液混匀后即为染色液。取出凝胶放入染色缸,倒入染色液,黑暗中温育胶 30 min～ 60 min,直到蓝带显示。

苹果酸酶:称取 10 mg NADP,10 mg M T T和5 mg PMS溶解于 10 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中 ,量取 5 mL 1% MgCl2和 25 mL 0.5 mol/L苹果酸(pH 7.0),混入上述溶液,即为染色液。取出凝胶放入染色缸,倒入染色液,黑暗中温育胶,直到谱带显示。

苹果酸脱氢酶:称取 10 mg NAD,10 mg NBT,5 mg PMS溶解于 25 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中 ,量取 25 mL 0.5 mol/L苹果酸 (pH 7.0),混入上述溶液,即为染色液。取出凝胶放入染色缸,倒入染色液,温育胶,直到谱带显示。凝胶在黑暗中37°C保温 2 h以上,酶带活性区带呈现深蓝色。

5)同功酶位点的确定和等位基因的命名。在表示同功酶位点和等位基因时,由酶的缩写字母代表酶系统,连字符后的数字代表不同的位点,距正极最近的位点为1,其他各位点依次用2,3,4,…表示。对同一位点,等位基因的确定根据谱带的迁移率,依次用 A,B,C,…表示。无活性或活性极弱的谱带用SA表示。

2 结果与分析

2.1 油松群体间形态特征值变异分析

所测定的 5种油松林分针叶、球果、种子性状特征值见表 4。

表 4 5种油松林分针叶、球果、种子性状特征值

从表 4可以看出,油松不同群体间针叶长变幅为 7.3 cm～ 12.9 cm;球果长变幅 4.2 cm～6.6 cm,球果宽变幅 2.9 cm～ 4.4 cm;百粒重变幅 3.3 g～6.4 g。针叶和球果的变异系数明显小于百粒重的变异系数,说明百粒重受环境影响较大。

进一步对油松不同群体间针叶、球果、种子性状特征值进行方差分析,见表 5。

表 5 针叶、球果、种子性状方差分析

由表 5看出,各性状方差分析结果表明,在α=0.05水平上,各形态特征在群体间和群体内均无显著差异。

2.2 同功酶分析

2.2.1 酶谱分析

1)GOT:在所有分析的单株中均有 2个染色区,分别定名为 GOT-1和 GOT-2。 GOT-1有2种谱带表现形式,1种是最常见的慢带(等位基因 A),1种是快带(等位基因 B)。 GOT-2有 3种酶谱表现形式。GOT重复性好,在林木研究中已有很多报道,不同树种在 GOT的位点上存在差异。

2)ADH:在分析的单株中有 1个染色区,受1个位点控制,有3种谱带表现形式。

3)SDH:在分析的单株中有 1个染色区,受1个位点控制,有3种谱带表现形式。

4)MDH:在分析的单株中有 2个染色区,受2个位点 (MDH-1,MDH-2)控制 ,其中 MDH-1有3种谱带表现形式,MDH-2有 4种谱带表现形式。目前,大部分研究中报道,MDH受 4个位点控制,但也有一部分报道受 3个或 2个位点控制。

5)M E:在所有的单株中均有 1条清晰的谱带,属于 1个染色区,受1个位点控制。该位点只有1个等位基因,属单态位点。

2.2.2 群体基因变异水平

5种群体在 7个位点上的等位基因频率(fij)和平均期望杂合度 (He),见表 6。

表 6 5种群体的等位基因频率及期望杂合度

从表 6知,有 6个位点(GOT-1,GOT-2,ADH-1,SDH-1,MDH-1,MDH-2)是多态的,1个位点是单态的(ME-1)。各个位点在 5种群体中的He平均值,按大小次序为 SDH-1(0.398),ADH-1(0.251),MDH-1(0.238),MDH-2(0.223),GOT-1(0.197),GOT-2(0.126)和M E-1单态位点。群体平均期望杂合度的平均值在位点间变化范围较大,说明不同位点间存在着较大的异质性。

进一步对 5种群体的遗传参数进行分析,见表7。

表7 5种群体的遗传参数

由表 7可见,多态位点百分率在 5种群体间相同。群体平均期望杂合度(He)代表了群体内杂合体的比例,在 5种群体中,变化范围为 0.153～ 0.251,平均为 0.208。等位基因平均数直观地反映了群体内等位基因的丰富度,其变化范围为 2.00～ 2.43,群体间变异很小。可见,5种群体的 3个遗传多态参数的均值较小,说明这 5种群体在研究的酶位点上变异水平较低。

2.2.3 群体间的遗传分化

为确定所研究的5种油松天然群体同功酶位点上的变异总量在群体间和群体内的分布情况,对群体变异量(Hs)、总变异量(Ht)做基因多样度分析并计算群体分化值(Gst),结果见表8。

表 8 遗传分化参数

从表 8中看出,Gst值在位点间变动幅度较大,变化范围从 0.006 0～0.070 9。 7个位点上的Gst平均值为 0.049 8,即群体间的变异量平均占总群体的4.98%,而大多数的变异(95.02%)存在于群体内。

2.2.4 群体遗传距离

为了进一步分析 5种油松群体间的相似程度,依据表6中的等位基因频率计算出各群体间的遗传距离 (Nei's方法),结果见表 9。

表 9 各群体间的遗传距离

从表 9知,群体 4与群体 5遗传距离为 0.991 3,群体 1与群体 4,群体 5的遗传距离分别为 0.986 4和0.990 5。5种群体的遗传距离变动范围较小,非常接近,说明群体间的分化程度不高。

3 结论与讨论

1)5种油松群体间针叶、球果、种子的形态特征值之间差异不显著。

2)酶谱分析表明,GOT在所有分析的单株中均有 2个染色区,分别定名为 GOT-1和 GOT-2。ADH在分析的单株中有 1个染色区,受 1个位点控制,有 3种谱带表现。 SDH在分析的单株中有 1个染色区,受 1个位点控制,有 3种谱带表现。MDH在分析的单株中有 2个染色区,受 2个位点(MDH-1,MDH-2)控制,其中 MDH-1有 3种谱带表现形式,MDH-2有4种谱带表现形式。ME在所有的单株中均有 1条清晰的谱带,属于 1个染色区,受 1个位点控制,该位点只有 1个等位基因,属单态位点。

3)群体基因变异水平表明,5种群体在 7个位点的等位基因频率(fij)和平均期望杂合度(He)在不同酶位点间存在着较大的异质性。 5种群体的遗传参数结果表明,多态位点百分率、群体平均期望杂合度、等位基因的遗传差异都很小。

4)群体间的遗传分化主要来自于群体内个体间(95.02%)。群体间的变异量很小,平均占总群体的4.98%。

[1]葛 颂,黄敏仁.马尾松 GO T.LDH-UM DH同功酶的遗传卞式和连锁关系[J].遗传学报,1987,14(2):428-435.

[2]杨一平.长白山红松林同功酶遗传变异的研究 [J].东北林业大学学报,1986,14(2):34-41.

[3]胡能书 .同功酶技术及其应用[M].长沙:湖南科学技术出版社,1985.

Study on Seed of Natural Population,Cone Morphology and Genetic Variation of Chinese Pine

Chen Hailong,Jia Aiping
(Fine Cultivar Breeding Center of Shanx i,041500Xiangfen,China)

The study on isoenzyme of5natural population of Chinese pine was carried out.The results showed that:1)Five populations all showed different band type in the analysis of GOT,ADH,SDH and MDH.Also,each plant has a clear band for M E analysis,which belongs to the same staining region controlled by one gene locus site where there is only one allele of singlet site.2)There exist differences on allele frequency of 7 sites and expected heterozygosity in 5populations among different enzyme sites. 3)Genetic differentiation among populations is mainly from individuals in the intrapopulations,accounting for 95.02% of the whole population.

Chinese pine;naural population;isoenzyme

S791.254

A

1007-726X(2010)01-0004-04

国家林业局“六大”重点林业工程科技专项(2003-007-L07)

2009-12-25

陈海龙(1965- ),男,山西襄汾人,1991年毕业于北京林业大学,工程师。