牙鲆EST资源的SSR信息分析

陈松波，龚 丽，刘海金

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.中国水产科学研究院，北京 100039）

微卫星（Microsatellites）也叫简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），是目前稳定性和多态性相对较高、具共显性、分布均匀且数量丰富的一种分子标记，被广泛应用于动植物的遗传研究和育种实践中。例如构建遗传图谱[1]、进行QTL定位[2]、亲缘关系鉴定[3-4]及遗传多样性分析[5-6]等。传统上，分离SSR标记是依赖于对基因组文库的构建，采用的是重复序列探针和阳性克隆测序来开发基因座上的特定引物。这种方法虽适用于许多生物，但是由于技术复杂，费时费力，反而限制了基因组SSR的进一步利用。

随着国际公共数据库中基因组DNA序列激增，表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）自1991年起也呈指数增长趋势。而大多数表型差异基本上是DNA水平上变化引起的，特别是表达基因的碱基序列，因此，通过搜索现成的数据库来发掘SSR标记，极大地缩短了标记开发时间，同时节省了大量经费。目前从EST中开发SSR标记正成为新标记开发的焦点，尤其是在植物上已开展了多个物种EST-SSR标记的开发及应用，如西瓜[7]、白菜[8]、油菜[9]、香菇[10]、柑橘[11]等。自2000年起，也相继展开了从鱼类（如罗非鱼[12]），贝类（如海湾扇贝（Argopecten irradians）[13]）及虾类（如中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）[14]）的EST中开发SSR标记的研究。Serapion等2004年就曾报道从斑点叉尾（Ictalurus punctatus）数据库中采用生物信息学方法开发EST-SSRs的研究[15]。Yue等从鲤鱼部分EST数据库采集数据开发出一些EST-SSR标记，并将这些标记应用于银鲫的遗传性分析[16]。本研究将对NCBI数据库中所有牙鲆（Paralichthys olivaceus）EST序列进行SSR检索，并分析ESTSSR分布的频率及碱基重复特点，为牙鲆ESTSSR的遗传分布规律提供一个基本的认识，并为牙鲆EST-SSR标记的开发及应用研究提供有价值的信息。

1 材料与方法

1.1 牙鲆EST来源

从 NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）中搜索所有牙鲆的EST序列，搜索结果均以FASTA格式显示，并且以文本文件的格式保存，用于生物信息学分析。

1.2 EST的预处理

对检索到的EST序列采用VectorNTI Contig-Express软件进行重叠群分析和聚类以去除冗余序列，除去5'端或3'端的polyT或polyA，初始装配参数为最小重复碱基数（Minmatch）为20，最小得分值（Minscore）为40，每一个聚类需经过检查以确保其准确度，从而避免由微卫星重复基元和长字符串引起的假聚类。

1.3 牙鲆EST中SSR的筛选

在线（http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool）对聚类后的EST进行微卫星序列搜索。选取重复次数在6次及以上的双碱基重复序列，5次及以上的三碱基重复序列，重复次数在4次以上的四碱基和五碱基重复序列，重复次数在3次以上的六碱基重复序列均为完全重复，并对搜索出的SSR的频率与长度进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 牙鲆EST-SSRs的分布频率

本研究共搜索到8 842条牙鲆ESTs序列，这些序列来自其头、肾、肝脏、脾脏、肌肉、心脏、脑、肠、胃、卵巢、皮肤等多个组织的cDNA克隆。经聚类和组合后，共得到5 927条无冗余EST序列，总长度为3.72×106bp，平均长度为627 bp。在线进行SSR的搜索结果表明，这些无冗余的EST序列共发现分布于390条EST中的471个SSR，平均7.9 kb出现1个SSR，出现频率为7.95%。在390条含有SSR的EST中，只含有1个SSR的EST有313条，含有2个SSR的有62条，含有3个SSR的有13条，含有4个SSR的有2条。SSR重复基元类型丰富，包括二碱基序列、三碱基序列、四碱基序列、五碱基序列和六碱基序列。重复基元含量最多的为二核苷酸重复，共有278个，所占比例达到全部SSR的59.02%，在全部EST中的出现频率为4.69%；其次为三核苷酸重复，占全部SSR比例的26.33%，出现频率为2.09%（见表1）。四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复类型很少，合计占所有类型的14.65%，其中五核苷酸序列重复类型最少，仅占0.21%。由此可见，在牙鲆EST-SSR中，二核苷酸重复占主导地位。

2.2 牙鲆EST-SSRs的特点

所筛选出的EST-SSRs共包括112种重复基元，其中二核苷酸重复基元10种，三核苷酸重复基元38种，四核苷酸重复基元34种，五核苷酸重复基元1种，六核苷酸重复基元29种（见表2）。

二核苷酸重复基元以AC最多，占二核苷酸重复基元类型的16.91%，其次是TG、CA、GT、TA、GA，分别占二核苷酸重复基元类型14.03%、13.67%、12.59%、9.71%和8.63%。三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元种类较多，但核苷酸重复基元类型分布相对分散，出现频率较低，所占比例也不高，其中三核苷酸重复基元GAG、CAG和CTG分别占所有三核苷酸重复基元类型的7.26%、6.45%和6.45%（见表3）。五核苷酸重复基元种类最少，仅出现（TTTAT）n一种重复。

表1 牙鲆EST中SSR出现的频率Table 1 Occurrence frequency of SSRs in a set of Japanese flounder ESTs

表2 牙鲆EST-SSR的重复基元Table 2 Repeat motif of EST-SSRs in Japanese flounder

2.3 牙鲆EST-SSRs的理论多态性与可用性分析

牙鲆的基序长度主要集中在12～24 bp。18 bp的基序长度最多，有78个，包括9次重复的二核苷酸基元、6次重复的三核苷酸基元和3次重复的六核苷酸基元。其次是15 bp，数量为65个，系五次重复的三核苷酸基元。基序最长的为132 bp，为二核苷酸基元的66次重复。基序长度在12～20 bp的 SSR占全部 SSR的 72.4%，20～30 bp的占17.41%，大于30 bp的占10.19%。

Temnykh等研究发现，当SSR基序长度大于或等于20 bp时多态性较高，长度在12～20 bp之间的多态性中等，而长度在12 bp以下时多态性极低[17]。依照此标准可推测72.4%的牙鲆ESTSSR具有中等多态性，17.41%的EST-SSR具有较高多态性。本研究所得的主要基元是二、三核苷酸重复基元，均属于低级基元，表明牙鲆的ESTSSR大部分具有高多态性潜能，并具有较高的可用性。

表3 主要二核苷酸和三核苷酸重复基元发生频率Table 3 Frequency of main repeat motif in dinucleotide and trinucleotide

3 讨 论

本研究分析了牙鲆EST序列中SSR的分布频率和重复基元的特点，发现NCBI数据库中大约有7.95%的牙鲆EST能够检索出SSR，这一比例低于斑节对虾（Penaeus monodon）[18]（13.7%），红旗东方（Fugu rubripes）[19（]11.5%）和斑点叉尾[15]（11.2%），但又高于栉孔扇贝（Chlamys farreri）[20]（1.61%）、中国对虾[14（]2.2%）、长牡蛎（Crassostrea gigas）[21]（3.63%）海湾扇贝[22]（3.9%）、真鲷（Chrysophrys major）[23]（4%）和鲤鱼[24]（5.55%）。这些差异可能由EST-SSR在水产动物中高度的物种特异性引起，也可能是由于用来搜寻SSR的软件不同，所设定的参数不同而造成的。

cDNA文库的随机序列使得EST中的冗余序列比例较高，为了降低分析数据的长度，应消除冗余序列。本研究中，EST-SSRs的平均密度在去除冗余序列之前是11.54 kb，而去除之后，平均每7.9 kb出现1个SSR。因此，在非冗余EST序列中，SSRs的分布频率能更准确地反映其在转录基因组中的密度。

本研究发现牙鲆EST-SSR重复基元以二核苷酸为最多，占所有SSR的59.02%，其次是三核苷酸重复，占所有SSR的26.33%，这与中国对虾[25]的研究结果相一致，而大多数植物的EST-SSR都以三核苷酸重复为主[26-27]。牙鲆二核苷酸重复中AC为优势基元，这与鲤鱼[24]和斑点叉尾[15]的研究结果相一致。而在栉孔扇贝中二核苷酸重复中出现频率最高的为GC[20]，斑节对虾中出现频率最高的二核苷酸重复基元为AT[18]，长牡蛎[21]和美国黄金鲈[28]中以AG/CT重复基元的数量最多。在本研究的二核苷酸重复中各种类型的均具有，而长牡蛎中未检测出CG重复[21]。这种不同物种EST-SSR主导类型的差异可能是由于各报道中所用EST来源和EST数目不同所致。牙鲆的三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸基元种类繁多，分别为38、34和29种，但是基元分布相对分散。其中，三核苷酸重复基元略有优势的为GAG、CAG和CTG，所占比例仅为三核苷酸重复基元类型的7.26%、6.45%和6.45%，这说明碱基偏倚性不太明显。

4 结论

牙鲆EST-SSR的出现频率较高，且类型丰富。从多态性潜能角度考虑，这些EST-SSR也具有较高的可用性。本研究对牙鲆EST-SSR的遗传分布特点进行了归纳总结，为进一步开发牙鲆ESTSSR标记提供了基础资料。EST-SSR标记的开发成本相对较低，且具有较高的通用性，因此，在亲缘关系鉴定、群体遗传学、比较基因组学以及功能基因组学等研究方面都具有重要的利用价值。

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