杆菌肽的生物法检测及发酵条件研究

周 欣 ，张 丽 ，李雄飞

（1.保定职业技术学院，河北 保定 071000；2河北农业大学，河北 保定 071001；3北京正大集团，北京 101301）

杆菌肽是由地衣芽孢杆菌或枯草杆菌变种的培养液分离而得。杆菌肽对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，抗菌谱与青霉素G相似，主要用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染，还可用作饲料添加剂。[1]。目前杆菌肽的工业生产主要通过微生物发酵法制得，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是目前广泛应用的工业生产菌种。我国的杆菌肽发酵生产始于20世纪60年代，随着我国畜牧养殖业的兴起，于上个世纪90年代开始大量生产杆菌肽，以芽孢杆菌为菌种，玉米和豆粕为主要原料，通过生物发酵、锌络合制备而成[2]。试验对杆菌肽的生物法检测和发酵条件进行了研究。

1 材料

（1）菌株：地衣芽孢杆菌，本实验室保存。

（2）主要培养基：营养肉汤培养液、营养肉汤固体培养基；发酵培养液：丙三醇15 g，谷氨酸0.5 g，磷酸钠14.3 g，硫酸镁0.025g，蒸馏水 1000mL，pH7.5。

（3）主要仪器：低速离心机（北京医用离心机厂），全温振荡培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造），PHS－3C数字酸度计，光学显微镜（OLYMPUS-CH2），724微机型可见分光光度仪（上海光学仪器制造厂）。

2 方法

2.1 地衣芽孢杆菌的生长曲线测定

将菌株接入第一瓶营养肉汤培养基中37℃培养，12小时后将菌接入第二瓶营养肉汤培养基中，37℃培养。从第二瓶接入种开始计时，每隔30 min同时取两瓶中的培养液用722分光光度计测其在600 nm的OD值，测定该菌株生长曲线[3]。

2.2 地衣芽孢杆菌的发酵时间的影响

将250 mL三角瓶中，装40 mL营养肉汤培养基，菌接入营养肉汤培养基中，37℃，200 r/min培养备用；500 mL三角瓶中装40 mL发酵液，按10%的接种量将备用菌液接种于发酵培养液中，37 ℃，200 r/min 培养。培养 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 时取样，4000 r/min 离心 10 min，取上清，以此标记为 A、B、C、D、E、F、G，放冰箱下层（-20 ℃）保存[4]。

2.3 抑菌溶液的配制

（1）样品发酵液的稀释：将B、C发酵培养液的上清液按估计值 600 u/mL稀释至 1 u/mL和 4 u/mL；D、E、F、G 发酵液按800u/mL稀释至1u/mL和4u/mL，稀释方法如下：

稀释至4u/mL，见表1。

表1 发酵液按估计浓度稀释至4 u/mL加样表

稀释至1 u/mL

取4 u/mL的样品发酵液稀释液1 mL，与pH6.0的磷酸缓冲液3mL混合得到。

（2）标准品溶液的稀释：取0.2 g 53.5 u/mg的标准品，用0.01 M盐酸，定容至100 mL，配成100 u/mL的备储标准溶液Ⅰ。取备储标准溶液110 mL，用0.01 M盐酸，定容至100 mL，配成10 u/mL的备储标准溶液Ⅱ。按下表，取储备标准液Ⅱ与0.01 M盐酸，用pH6.0的磷酸缓冲液定到100 mL。得到浓度为1 u/mL和4 u/mL的标准品溶液，见表2。

表2 标准液稀释至1u/mL和4u/mL加样表

2.4 杆菌肽产量生物法测定

每个藤黄八叠双层平板上放置4个牛津杯，其中一条对角线上的两个牛津杯中分别注入浓度为1 u/mL和4 u/mL的标准品溶液；另一条对角线上分别注入取样品发酵液稀释到的 1 u/mL和 4 u/mL浓度的溶液[5]。

3 结果

3.1 地衣芽孢杆菌的生长曲线测定

结果如图1可知其生长对数期在4～12 h之间，选择10 h做为种子培养时间。

图1 地衣芽孢杆菌生长曲线图

3.2 芽孢杆菌的发酵时间的影响

培养 24 h、31 h、48 h、54.5 h、82.5 h、96.5 h、120 h 时取样，4000 r/min离心10 min，取上清，以此标记为，放冰箱下层（-20℃）保存。

抑菌实验：通过生物法测定 A、B、C、D、E、F、G 7 个样品中杆菌肽的抑菌情况。结果见表3。

表3 不同抑菌时间抑菌直径测量数据表

P为样品发酵液的效价浓度

AT为样品发酵液的估计浓度

S1为浓度为1u/mL的标准品溶液的抑菌圈直径

S4为浓度为4u/mL的标准品溶液的抑菌圈直径

T1为浓度为1u/mL的样品发酵液的抑菌圈直径

T4为浓度为4u/mL的样品发酵液的抑菌圈直径

应用公式：P=（T1+T4）/（S1+S4）*AT计算，结果见表4。

表4 不同时间发酵液杆菌肽含量表

根据表4得到杆菌肽的产生趋势：

图2 杆菌肽产生趋势图

由图2可知，在发酵的前期（6～24 h），杆菌肽产生呈上升趋势；在发酵的中后期（24～54 h），杆菌肽的产量稳定，综合分析以及从成本考虑得到杆菌肽的产生情况为：选择发酵35 h，杆菌肽产量为，642.7 u/mL。

4 结语

通过对杆菌肽产生菌进行初步发酵条件摸索，首先将筛选到的菌株在营养肉汤细菌培养基进行种子瓶培养，通过间隔时间取样测量菌体密度，确定种子瓶生长曲线。选择菌体量较大，且菌体活力旺盛的对数生长后期作为发酵培养基的接种时间。这样可保证菌株尽快繁殖代谢，以产生我们需要的杆菌肽。最终，实验确定摇瓶培养10 h为种子瓶最佳时间。

发酵过程中，杆菌肽的生物检测采用2005版中国兽药药典规定的抑菌圈法。生物法检测仪器要求不高，通过发酵液对敏感菌藤花八叠球菌的抑菌圈直径大小确定杆菌肽效价，为避免测量过程中各个平皿之间的误差，每个平皿采用杆菌肽标准品同时测定，以校正误差。通过对杆菌肽发酵过程监控，确定杆菌肽的产生情况为：选择发酵35 h，杆菌肽产量为，642.7 u/mL。

[1]Raussens V，Narayanaswan V，Goormaghtigh E，et al.Hydrogen/Deuterium exchange Kinetics of apolipophorin-III in lipid-free and phospholipids-bund states[J].J Biol chem，1999，27（4）：89-95.

[2]薛志成.杆菌肽锌在畜禽饲养中的应用.养殖与饲料[J].饲料与营养，2006，（1）：23-24.

[3]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[4]沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2002.