衣原体噬菌体Chp3衣壳蛋白Vp1二级结构及B细胞抗原表位预测

姚卫锋，刘原君，李燕，齐蔓莉，田敬群，刘全忠

（天津医科大学总医院皮肤科，天津 300052）

沙眼衣原体（Chlamydial trachomatis,C.t）感染所引起的非淋菌性尿道炎（non-gonococcol Urethritis,NGU）在我国以及欧美国家已成为最常见的性传播疾病（sexually transmitted infection,STI）之一[1]，常迁延难愈，相关耐药报道逐年增多，但迄今为止尚无理想的疫苗问世，已成为临床治疗的棘手问题。噬菌体（bacteriophage;phage）不仅是分子生物学研究的重要工具，作为抗菌剂治疗细菌感染的潜能也日益受到重视。其中将噬菌体作为一项有效的治疗手段用于一些重要的病原菌如金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌等感染的研究已成为国际研究的新热点。近年来在鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和家畜衣原体中陆续发现了衣原体噬菌体，它们属微病毒家族，具有20面对称衣壳--由衣壳蛋白Vp1、Vp2和Vp3构成[2]。其中Vp1蛋白为分子量最大的蛋白分子，结构保守而特异，是在其它衣原体种——尤其是沙眼衣原体寻找衣原体噬菌体的良好标志物。虽然衣原体噬菌体研究揭示了这些噬菌体的基因、镜下结构和分子特征，但对它的作用尚不清楚--这也是急待解决的问题。目前只有国外的几个实验室保有发现的衣原体噬菌体株，本文旨在通过生物信息学分析，预测Vp1蛋白的二级结构及其优势表位，为之后的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 衣原体噬菌体Chp3Vp1氨基酸序列Genbank序列号为YP_022479.1。

1.2 GH蛋白二级结构预测应用DNAStar软件提供的Protean模块进行，采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白二级结构。B细胞表位预测以7个氨基酸残基为一组，分别按 Kyte-Doolittle、Emini和 Jameson-Wolf方案预测其亲水性、表位可能性和抗原性指数。

2 结果与分析

2.1 衣原体噬菌体Chp3Vp1蛋白序列

“MVRNRRLPSVMSHSFAQVPSARIQRSSFDRSCGLKTTFNAGY LIPIFCDEVLPGDTFSLKEAFLARMATPIFPLMDNLRLDTQYFF VPLRLIWSNFQKFCGEQDNPDDSTDFLTPVLTAPTGGFTEGSI HDYLGLPTKVAGVQCAAFWHRAYNLIWNQYYRDENIQESV EVQMGDTTTDEVKNYELLKRGKRYDYFTSCLPWPQKGPAV TIGVGGKAPIEGLYMNVNSNNPVGKFVLDSQSTPRVLQDLQG NKLSGIAAYNQTGKHVYVNSAWYTVTPQSEPGATLENGNYY TTQKPQIYADLGATSPVTINSLREAFQLQKLYERDARGGTRYI EIIRSHFNVQSPDARLQRAEYLGGSSTPVNISPIPQTSSTDSTSP QGNLAAYGTAIGSKRVFTKSFTEHGV ILGLASVRADLNYQQ GLDRMWSRRTRWDFYWPALSHLGEQAVLNKEIYCQGPSKNS GGEIVDEQVFGYQERFAEYRYKTSKITGKFRSNATSSLDSWH LAQ EFENLPTLSPEFIEENPPMDRVLAVSNEPHFLLDGWFSLR CARPMPVYSVPGFIDHF”。

序列含565个氨基酸，理论分子量为63.628ku，等电点为6.67。

2.2 蛋白二级结构预测 使用不同的预测分析方法，所预测的蛋白二级结构亦不完全相同，其所含有的α螺旋、β折叠和转角的数目和存在位置表现出一定的差异。Chou-Fasman方案示：α螺旋、β折叠相间、同时其间有转角结构（该结构与柔性区域重叠）的区段为N端42-95（2个α螺旋、3个β折叠），162-190（2个 α 螺旋、1个 β 折叠），291-356（3个 α螺旋、3个β折叠）；358-417含2个β折叠，其间有转角结构（该结构与柔性区域重叠）；441-482含3个α螺旋，其间有转角结构（该结构与柔性区域重叠）。Gamier-Robson方案示：全序列大间隔分布4个小片段α螺旋，小间隔密集分布β折叠—其间隔区有转角结构（该结构与柔性区域重叠）。Karplus-Schulz方案预测蛋白的柔性区域，发现该蛋白的柔性区域大体呈散在性分布，于N端160-266区段密集小段分布，较大的柔性区为19-31，101-114，119-128，277-297，357-383，457-471（图 1）。

图1 不同方案预测Chp3Vp1二级结构结果

2.3 蛋白B细胞表位可能性预测结果 以Kyte-Doolittle及Hopp-Woods方案分析，蛋白亲水性较高的 区 域 为 N 端 第 1-10，20-35，77-82，101-114，149-197，224-232，237-254，259-270，274-300，314-333，342-359，369-385，359-403，415-438，458-469，472-516，518-528 区段。Jameson-Wolf法预测抗原指数显示，大多数的高抗原指数区域与预测的亲水区重合。Emini方案预测氨基酸残基位于蛋白质的表面可能性，显示N端第1-10，103-110，156-168，177-197，289-300，320-332，426-436，475-489区段很可能位于蛋白质的表面，这些可能的表面区段都位于蛋白的亲水区域。提示位于蛋白质表面的可能性区域都可能是B细胞表位优势区域（图2）。

图2 Chp3Vp1蛋白的抗原表位预测

3 讨论

蛋白质结构预测，是指直接从氨基酸序列推断某一蛋白质的功能位点或预测其三维结构，包括二级和三级结构预测，是目前分子生物学研究中迫切需要解决的问题，是最重要的课题之一[3]。蛋白质的二级结构是指肽链中局部肽段的构象，它们是完整肽链构象(三级结构)的结构单元，是蛋白质复杂的空间构象的基础。各类二级结构的形成几乎全是由于肽链骨架中羰基上的氧原子和亚胺基上的氢原子之间的氢键所维系。其他的作用力，例如范德华力等，对维系结构稳定也起一定作用[4]。最早的蛋白质二级结构是Pauling等于1951年提出的α-螺旋、β-折叠和转角。α-螺旋、β-折叠的化学键能较高，结构规则稳定不易形变。转角可看成是由几个氨基酸构成的最小的反平行的β片层，最常见的是β转角。由于转角中含有相当比例的极性残基，使得大多数β转角存在于分子表面，为凸出结构，极少在分子的内部。为此，转角及其附近比整个分子有更大的亲水性，利于与抗体嵌合，而且糖基化以及磷酸化等转译后的加工通常发生在β转角或其附近区域。还发现转角这种二级结构在进化中保守性比氨基酸序列的保守性强，这提示β转角对蛋白质的结构、功能和进化都有重要意义[5~7]。Garnier-Robson法和Chou-Fasman法都预测到蛋白的β-折叠比α-螺旋的数量多，可以认为蛋白的二级结构以β-折叠为主；并且预测到Vp1蛋白有频繁出现的转角和无规则卷曲区域，提示Vp1蛋白有较为复杂的空间结构，存在众多的转角区域可作为候选的B细胞抗原表位。

根据不同的参数，我们预测了蛋白潜在的B细胞抗原表位。二级结构对蛋白质的抗原表位有很大的影响。α-螺旋、β-折叠结构规则，依靠氢键维持，不易形变，很难找到与之相应的配体，常位于蛋白质内部，主要起稳定蛋白质分子结构的作用不易形成抗原表位；而转角及无规则卷曲等二级结构则是比较松散的结构，易于发生扭曲且结构突出，多位于蛋白质分子表面，形成抗原表位的可能性较大，从而构成蛋白质的功能区域[8]。蛋白质分子的亲水性也与其抗原表位构成有密切的联系，在蛋白质分子中疏水性氨基酸残基一般埋藏在蛋白质分子内部，而亲水性氨基酸残基位于蛋白质分子表面，在表面电荷和极性最大的亲水性区域上通常形成蛋白质的抗原表位[9]。但由于亲水性部位与抗原表位没有高度一致的相关性，即高亲水性部位不一定都是B细胞抗原表位，抗原表位也不一定都是高亲水性部位。因此，针对蛋白质抗原表位中的氨基酸残基出现频率研究建立了蛋白质B细胞抗原表位的抗原指数分析方案。通常情况下，Leu/Thr/Pro/Asp/Asn/Glu/His/Lys/Arg等氨基酸残基出现的频率越高，其抗原指数就越大，能形成抗原表位的可能性也就越高。抗原指数分析结果表明有24个集中的抗原表位区域且指数值较高，在其中筛选活性较强并能表现其活力的区域还需要综合分析其结构、亲水性及柔韧性等因素。根据预测结果综合分析，蛋白N端第1-10，101-112，159-166，174-184，189-195，288-299，323-333，419-435，477-490是B细胞的优势表位。

本课题组已通过原核表达得到大量纯化的Chp3Vp1蛋白,希望通过该重组蛋白用于临床标本中筛查沙眼衣原体噬菌体并探讨其对沙眼衣原体的作用。然而为了研究过程更有针对性，还必须深入研究其结构及相应的构效关系。生物信息学技术是通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，达到揭示数据所蕴含生物学意义之目的[10]。重点主要体现在基因组学和蛋白组学两方面，具体说就是从核酸和蛋白质序列出发，分析序列中蕴含的结构功能信息，是分子生物学研究的有力工具。我们应用相应分析工具分析了Vp1蛋白的序列信息，为进一步研究奠定基础。

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