同时检测恩诺沙星和环丙沙星单克隆抗体的制备

郭杰标，许 杨，刘师文

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，江西 南昌 330047)

氟喹诺酮是一类强效、广谱的合成抗菌素，通过抑制细菌DNA解旋酶发挥抗菌效力[1]。这类药物在畜牧、水产业被广泛应用治疗和预防细菌感染，并作为饲料添加剂促进动物的生长[2]。恩诺沙星是兽药领域最常用的氟喹诺酮药物，我国制定了在食品中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的总残留限量标准(MRLs)，以避免这两种药物在食品中的残留所造成的细菌耐药性和过敏反应等健康危害。

目前，检测食品中恩诺沙星及环丙沙星总残留量的主要微生物法[1]和仪器学方法，包括液相色谱和液相色谱-质谱[3-6]，毛细管电泳[7]等。微生物法检测周期长，而仪器学方法需要昂贵的设备且运行费用高，难以在基层检测部门广泛推广。检测一种氟喹诺酮药物[8-10]和检测氟喹诺酮药物总量[11-13]的免疫学方法已有报道，但是同时检测食品中恩诺沙星及环丙沙星总残留量的免疫学法还有待开发。恩诺沙星和环丙沙星的分子结构式见图1，本研究采用环丙沙星作为代表半抗原制备人工抗原，并将其免疫动物，获得针对恩诺沙星和环丙沙星的抗体，为建立同时检测这两种药品总残留量的免疫学快速检测方法提供条件。

图1 恩诺沙星和环丙沙星的分子结构式Fig.1 Molecular structures of enrofloxacin and ciprofloxacin

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

恩诺沙星和环丙沙星 中国兽医药品监察所；弗氏完全(不完全)佐剂、戊二醛、葡萄糖、乳糖、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA) 上海生工生物工程技术服务有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗 Gene Tex公司；96孔酶标板 Costar公司；其他试剂均为国产分析纯。

Ultrospec紫外-可见光扫描仪 美国安玛西亚公司；Multiskan MCC/340酶标仪 Labsystems公司。

1.2 实验动物

Balb/c小鼠(雌性，4周龄)购自南昌大学医学院实验动物中心(批准号为：赣(动)96-021)。

1.3 方法

1.3.1 糖基化牛血清白蛋白的制备[14]

葡萄糖、乳糖和载体蛋白按照20:20:1的物质的量比混合，调节至pH9.5，在40～42℃振荡2h，使还原糖上的醛基与蛋白质的氨基发生偶联，完成对载体蛋白的牛血清白蛋白糖基化修饰。

1.3.2 环丙沙星免疫抗原的制备

把糖基化BSA的质量浓度固定为2mg/mL，戊二醛投料质量浓度固定为60.6μg/mL，环丙沙星投料质量浓度分别为0.85、1.06、1.27mg/mL。调节pH9.5在25℃振荡12h，合成3种不同偶联比的环丙沙星免疫抗原。用0.05mol/L PBS(pH7.4)透析3d，备用。

1.3.3 环丙沙星检测抗原的制备

OVA的质量浓度为2mg/mL，戊二醛的投料质量浓度为44.4μg/mL，环丙沙星的投料质量浓度0.62mg/mL。调节pH9.5在25℃振荡12h，合成环丙沙星检测抗原。用0.05mol/L PBS (pH7.4)透析3d，备用。

1.3.4 环丙沙星人工抗原偶联比例的计算

环丙沙星区别于载体蛋白的特征吸收波长为340nm，在该波长下的摩尔消光系数K=4.5mL/mg，人工抗原蛋白浓度的测定使用双缩脲法[15]。

1.3.5 小鼠免疫

取4周龄的雌性Balb/c小鼠，以100μg/只的抗原剂量，加完全佐剂充分乳化后，皮下多点初次免疫。28d后，以不完全佐剂乳化抗原以加强免疫。之后每21d，以同样的方法进行加强免疫。对照组采用非糖基化载体制备的免疫抗原进行免疫。

1.3.6 抗体效价检测

参照Guo等[16]的方法，分别采用间接ELISA和间接竞争ELISA，测定免疫后小鼠血清的抗体效价和抗体对环丙沙星的特异性。

1.3.7 单克隆抗体筛选与鉴定

参照Guo等[16]的方法，筛选得到分泌抗环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞。并用间接竞争ELISA对所获得抗体的特性进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的合成

环丙沙星人工抗原的制备原理见图2。戊二醛是双功能试剂，通过和蛋白质上的氨基和环丙沙星哌嗪环上的亚氨基反应，可以实现环丙沙星和载体蛋白之间连接，使恩诺沙星和环丙沙星的共同结构暴露在人工抗原的外部，成为主要的抗原位点。

图2 人工抗原的合成Fig.2 Synthesis route of artificial antigen

环丙沙星人工抗原的连接效果，用紫外扫描图谱进行评价(图3)。按照1.3.2节制备的3种环丙沙星免疫抗原，经检测偶联比分别为6.3:1、7.2:1和8.3:1。按照1.3.3节制备的环丙沙星检测抗原，经检测偶联比为2.4:1。

图3 载体蛋白、环丙沙星和环丙沙星免疫抗原溶液的紫外扫描图谱Fig.3 UV absorption spectra of glycosylated BSA, ciprofloxacin and ciprofloxacin immunogen

戊二醛是很活泼的连接剂，很容易与蛋白质的氨基反应造成蛋白质聚集。图4是分别以糖基化载体和天然载体制备的环丙沙星抗原免疫的SDS PAGE图谱。泳道3显示，使用天然BSA制备的免疫抗原，在戊二醛作用下造成了载体蛋白蛋白的聚集。

图4 天然BSA和糖基化BSA制备的环丙沙星免疫抗原SDS-PAGE图谱Fig.4 SDS-PAGE patterns of ciprofloxacin immunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA

葡萄糖、乳糖是还原糖，分子结构中含有醛基，在偏碱性条件葡萄糖和乳糖会与BSA上的氨基缩合，把蛋白上的氨基封闭。泳道4显示，经过糖基化BSA分子质量比天然BSA(泳道2)增大。泳道5显示，以糖基化BSA为载体制备的环丙沙星免疫抗原，由戊二醛导致的蛋白质聚集现象得到了避免。

由此可见，使用糖基化载体制备环丙沙星免疫抗原，由于载体蛋白上的氨基数量减少，能够避免载体蛋白的聚集，同时增加环丙沙星免疫抗原的分子质量。

2.2 免疫小鼠效果

图5 糖基化载体和天然载体制备的抗原免疫小鼠的效果比较Fig.5 Comparison of antiserum titer induced by ciprofloxacin immunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA

本研究使用糖基化BSA为载体，如1.3.2节合成的3种偶联比的糖基化环丙沙星免疫抗原。前期合成的以天然BSA为载体制备环丙沙星免疫抗原中，免疫动物效果最好的是偶联比为9.1:1的抗原。本实验以天然BSA为载体制备的环丙沙星免疫抗原作对照，评价3种糖基化环丙沙星抗原免疫小鼠的效果。4种抗原免疫小鼠后抗体效价的上升曲线见图5。结果发现使用糖基化BSA为载体制备的3种免疫抗原，比对照抗原诱导小鼠产生抗环丙沙星特异性抗体的能力要强很多。

2.3 单克隆抗体的筛选与鉴定

本实验使用免疫效果最好的糖基化免疫抗原，在第4次免疫之后获得了较高的抗体效价。通过细胞融合，顺利获得了检测环丙沙星及其代谢前体恩诺沙星的单克隆抗体(1G3)。经用间接竞争ELISA进行鉴定，该抗体对这两种药品的IC50值分别为9.6ng/mL和10.2ng/mL，灵敏度和特异性能够满足同时检测这两种药品在食品中的残留的需要。

3 讨 论

环丙沙星是小分子物质，没有免疫原性，必须与载体蛋白偶联后才可以免疫动物产生抗体。经过分析和比较，发现把环丙沙星分子中哌嗪环上的亚氨基作为连接位点制备的人工抗原，有利于获得针对恩诺沙星和环丙沙星共同结构的抗体。

有文献报道，制备人工抗原的连接臂的最适长度在3～6个碳原子，连接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而连接臂太长又会造成折叠导致半抗原分子被载体蛋白掩盖不利于产生抗体[17]，戊二醛作为连接手臂正好符合3～6个碳原子的条件。戊二醛在碱性条件下可以与氨基或亚氨基缩合，能够把环丙沙星上的亚氨基连接到蛋白载体上。

戊二醛是很活泼的连接剂，很容易与蛋白质的氨基反应造成蛋白质聚集。使用糖基化载体制备免疫抗原，能够避免载体蛋白的聚集，同时增加环丙沙星免疫抗原的分子质量和免疫原性。通过免疫动物和细胞融合，筛选出了一株对恩诺沙星和环丙沙星IC50值分别为9.6ng/mL和10.2ng/mL的单克隆抗体，为建立同时检测这两种药品总残留量的免疫学快速检测方法提供了条件。

[1] ASHWIN H, STEAD S, CALDOW M, et al.A rapid microbial inhibition-based screening strategy for uoroquinolone and quinolone residues in foods of animal origin[J].Anal Chim Acta, 2009, 637(1):241-246.

[2] FLORENTINA C C, ANUNCIACION E M, de la PEA A M, et al.Determination of dano oxacin in milk combining second-order calibration and standard addition method using excitation-emission fluorescence data[J].Food Chem, 2009, 113(4): 1260-1265.

[3] CINQUINA A L, ROBERTI P, GIANNETTI L, et al.Determination of enrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin in goat milk by high-performance liquid chromatography with diode-array detection optimization and validation[J].J Chromatogr A, 2003, 987(1): 221-226.

[4] KREBBER R, HOFFEND F J, RUTTMANN F.Simple and rapid determination of enrofloxacin and ciprofoxacin in edible tissues by turbulent flow chromatography-tandem mass spectrometry (TFC-MS/MS)[J].Anal Chim Acta, 2009, 637(1): 208-213.

[5] GONZALEZ C, MORENO L, SMALL J, et al.A liquid chromatographic method, with fluorometric detection, for the determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma and endometrial tissue of mares[J].Anal Chim Acta, 2006, 560(1): 227-234.

[6] IDOWU O R, PEGGINS J O.Simple, rapid determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in bovine milk and plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J].J Pharm Biomed Anal, 2004, 35(1): 143-153.

[7] ZHOU Xiaoming, XING Da, ZHU Debin, et al.Development and application of a capillary electrophoresis-electrochemiluminescent method for the analysis of enrofoxacin and its metabolite cipro floxacin in milk[J].Talanta, 2008, 75(5): 1300-1306.

[8] LU Shengxin, ZHANG Yulan, LIU Jingting, et al.Preparation of antipefloxacin antibody and development of an indirect competitive enzymelinked immunosorbent assay for detection of pefloxacin residue in chicken liver[J].J Agric Food Chem, 2006, 54(16): 6995-7000.

[9] ZHAO Chenbiao, LIU Wei, LING Hongli, et al.Preparation of anti-gatifloxacin antibody and development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of gatifloxacin residue in milk[J].J Agric and Food Chem, 2006, 55(15): 6879-6884.

[10] SHENG Wei, XIA Xunfeng, WEI Keyi, et al.Determination of marbofloxacin residues in beef and pork with an enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Agric Food Chem, 2009, 57(13): 5971-5975.

[11] BUCKNALL S, SILVERLIGHT J, COLDHAM N, et al.Antibody to the quinolones and fluoroquinolones for the development of generic and specific immunoassays for detection of these residues in animal products[J].Food Addit & Contam, 2003, 20(1): 221-228.

[12] HUET A C, CHARLIER C, TITTLEMIER S A, et al.Simutaneous determination of (fuloro)quinolone antibiotics in kidney, marine products,eggs, and muscle by enzyme-linked Immunosorbent assay[J].J Agric and Food Chem, 2006, 54(3): 2822-2827.

[13] WANG Zhanhui, ZHU Yan, DING Shuangyang, et al.Development of a monoclonal antibody-based broad-specificity ELISA for fluoroquinolone antibiotics in foods and molecular modeling mtudies of cross-reactive compounds[J].Anal Chem, 2007, 79(12): 4471-4483.

[14] 许杨, 郭杰标, 黄志兵, 等.使用糖基化载体制备突出喹诺酮母核免疫抗原的方法: 中国, 200910115824.2[P].2009-08-27.

[15] 中华人民共和国药典: 二部, 附录VI B, 第三法[S].2005版.

[16] GUO Jiebiao, XU Yang, HUANG Zhibing, et al.Development of an immunoassay for rapid screening of vardenafl and its potential analogues in herbal products based on a group specifc monoclonal antibody[J].Anal Chim Acta, 2010, 658(2): 197-203.

[17] KIM Y J, CHO Y A, LEE H S, et al.Synthesis of haptens for immunoassay of organophosphorus pesticides and effect of heterology in hapten spacer arm length on immunoassay sensitivity[J].Anal Chim Acta,2003, 475(1/2): 85-96.