安宫牛黄丸药理和毒理实验研究进展

陆远富,吴芹,刘杰,2

(1.贵州省基础药理重点实验室及遵义医学院药理学教研室,遵义,563001;2.University of Kansas Medical Center,Kansas City,KS 66160,USA)

安宫牛黄丸是我国中药中最负盛名的急症用药,它来源于清代“瘟病条辩”,是中医治疗高热症的“瘟病三宝”之一。全方由牛黄、郁金、犀角、麝香、珍珠、栀子、黄连、黄芩、冰片、朱砂和雄黄11味药组成。临床上协同其他药物治疗脑出血、脑缺血性损伤、脑炎、中风等脑病及其所致的高热昏迷疗效独特[1]。由于组方中含朱砂(汞)、雄黄(砷)而引起人们广泛疑虑,其毒理作用被夸大,治疗作用被质疑。同样被涉及的其它含朱砂或雄黄的中成药上百种,仅中国药典收载含朱砂的46种,含雄黄的有26种[2],这不仅给制药企业造成巨大的经济损失,还严重影响中药声誉。那么,能否将安宫牛黄丸中的朱砂和雄黄去掉,其药理及毒理作用的基础是什么,为阐明这一问题,本文将其药理、毒理研究进展综述如下。

1 安宫牛黄丸药理研究

1.1 安宫牛黄丸对脑出血、脑缺血模型大鼠的影响

脑缺血、出血性损伤是安宫牛黄丸的主要适应证,临床上常采用口服、鼻饲或灌肠并配合其它药物和抢救措施,疗效肯定[1-3]。赵雍等[4]观察了安宫牛黄丸连续三天预防给药对大脑中动脉缺血模型大鼠的防治作用,发现安宫牛黄丸大、中和小剂量均能减少大鼠脑梗塞面积,降低脑含水量及皮层和海马脂质过氧化,并升高皮层的过氧化氢酶和谷胱甘肽酶。提示安宫牛黄丸对脑缺血模型大鼠具有一定的保护作用,并可能与其抗氧化作用有关。冯淑怡和孙建宁[5]采用大鼠右侧尾壳核内注入胶原酶所致脑出血模型,显示安宫牛黄丸能降低脑出血区周围脑组织MDA含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性。方芳等[6]采用同样模型,同样的给药方法和疗程,观察到安宫牛黄丸能降低脑组织含水量、脑指数,并改善神经功能。付宪文等[7]采用SD大鼠尾动脉切开取血法,将100μl自体非抗凝血在立体定向仪下缓慢注入大鼠右侧内囊制备脑出血模型,结果表明,研究了安宫牛黄丸对自发性脑出血模型大鼠血肿周围脑组织氨基酸表达及超微结构的影响。安宫牛黄丸给药1周后能降低脑组织谷氨酸和天冬氨酸含量,提高谷酰胺的含量,并减轻注射自体非抗凝血引起的神经细胞和血管损伤性变化。采用自体非抗凝血模型,安宫牛黄丸连续给药3 d也能降低大鼠血肿周围脑组织的含水量,改善神经功能障碍和病理变化[8]。综上所述,安宫牛黄丸在脑出血,脑缺血的急性动物模型产生一定的治疗和预防作用,其作用机制可能是多层次多方面的。

1.2 安宫牛黄丸对实验性脑炎、感染、发热的影响

脑炎、颅内感染和高热也是安宫牛黄丸的急症适应证[1-3]。朱坤杰等[9,10]采用大鼠尾静脉注射细菌内毒素(LPS,16 m g/kg)诱发脑损伤模型。安宫牛黄丸连续治疗3 d,对LPS脑损伤大鼠皮层脑电图以及皮层单胺类递质均有一定的影响。汤毅珊等[11]在SD大鼠经右侧颈总动脉插管注射百日咳菌液诱发感染性脑水肿模型,探讨了安宫牛黄散单次灌胃给药对感染性脑水肿的预防作用。结果发现给药后5 h大鼠血清以及脑组织中乳酸脱氢酶总活性降低,异构酶百分比改变。林璞粤等[12]采用SD大鼠外伤性脑水肿模型,发现安宫牛黄散能显著增高脑外伤后热休克蛋白m RNA表达,抑制脑组织一氧化氮合成酶活性,降低模型大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)α和白介素(IL)-1β水平,并由此推测安宫牛黄散可能通过诱导热休克蛋白表达,抑制炎症介质释放而产生脑保护作用。张锋等[13]采用大鼠原代神经元-胶质细胞联合培养体系制备模型,发现安宫牛黄丸对LPS诱导的小胶质细胞炎症有明显抑制作用,对LPS引起的多巴胺能神经元损伤有保护作用,该作用与降低LPS诱导的超氧化自由基产生和致炎症因子释放有关。叶祖光等[14]在新西兰家兔耳缘静脉注射伤寒Vi多糖菌苗发热模型上,观察到安宫牛黄丸能明显降低高热家兔体温。由此可见,安宫牛黄丸具有一定抗脑部感染作用。

1.3 “醒脑开窍”作用

临床上脑卒中,昏迷常加用安宫牛黄丸辅助治疗[1-3]。叶祖光等[14]选用雄性昆明种小鼠,观察了安宫牛黄丸与戊巴比妥钠的协同镇静作用,发现安宫牛黄丸可显著延长小鼠睡眠时间,对睡眠潜伏期无明显影响,提示其具有一定的镇静作用。朱坤杰等[9,10]应用安宫牛黄丸对LPS所致大鼠脑损伤模型的治疗作用中进行了脑电图研究,显示安宫牛黄丸可提高模型大鼠脑电图β波功率和相对功率,抑制δ波相对功率提高。在对脑组织单胺类递质测定中,发现安宫牛黄丸可改变大鼠脑内部分单胺类递质代谢,由此推测安宫牛黄丸改善脑电图和改变皮层单胺类递质可能是其促清醒作用机制之一。

综上所述,动物实验的研究为安宫牛黄丸防治出血性或(和)缺血性脑损伤,外伤性或(和)感染性脑水肿和炎症等脑病及伴有的高热、昏迷提供了一定的药理学依据。就目前的研究情况来看,在部分研究中,存在关键的病理和病理生理指标缺失,而分子生物学机制被不适当夸大的问题,用安宫牛黄丸治疗脑病的作用和作用机制仍有待更深入的研究。近年来,安宫牛黄丸因含砷、汞所致安全性评价越来越受到人们的关注。针对含与不含雄黄(砷)和朱砂(汞)的安宫牛黄丸的药理作用及其机制的研究也越来越多。试图找到雄黄和朱砂在安宫牛黄丸中存在的必要性,或者去除的合理性,使安宫牛黄丸在临床上的使用更科学,更安全。一些人认为朱砂和雄黄对安宫牛黄丸的整体药效的贡献可有可无[4,14],鉴于朱砂和雄黄含汞和砷,主张从安宫牛黄丸中去除。另一些人则认为朱砂和雄黄是安宫牛黄丸(散)治疗脑病的物质基础,不可或缺[6-7,9-11]。如近年来的研究表明,雄黄是安宫牛黄丸抗炎作用的有效活性成分之一[10,12-13]。朱砂和雄黄能否从安宫牛黄丸中去除,目前实验依据不充分,还需就其药理和毒理作用作出综合评价。

2 安宫牛黄丸的毒理研究

2.1 离体细胞研究

吴芹等[15]采用正常大鼠神经胶质HAPI细胞、正常大鼠肝TRL1215细胞、人肝癌HepG2和Hep3B细胞、人鼻咽癌FaDu细胞等5种细胞在体外比较了安宫牛黄丸、朱砂和雄黄与6种常见汞或砷化合物的毒性。结果发现不同的汞、砷化合物,其毒性不同,如朱砂的细胞毒只有甲基汞的1/5000,雄黄的细胞毒只有砒霜的1/10～1/20,而安宫牛黄丸的毒性大于朱砂低于雄黄。

2.2 在体小鼠实验

我们采用相当于临床用量6倍的安宫牛黄丸(3 g/kg)及相等含量的朱砂和雄黄与亚砷酸钠(相当于雄黄砷含量的1/10)和氯化汞(相当于朱砂汞含量的1/20)小鼠灌胃8 h后,观察到氯化汞和亚砷酸钠无论在肝肾功能的损害、肝肾的病理变化,肝肾的砷汞蓄积,还是对金属敏感基因(如金属巯蛋白,MT-1)的诱导上,都要比朱砂、雄黄和安宫牛黄丸所致变化严重得多,提示朱砂、雄黄和安宫牛黄丸的毒性不能与常见汞、砷化合物相提并论[16]。我们连续6周小鼠分别灌胃安宫牛黄丸、朱砂、雄黄、氯化汞(相当于1/10朱砂的汞含量),甲基汞(1/100朱砂的汞含量),亚砷酸钠(1/100雄黄的砷含量)和砷酸钠(1/50雄黄的砷含量),发现甲基汞和氯化汞对肾脏病理损伤最严重,砷酸钠、亚砷酸钠为中等,雄黄所致肾损害较轻,而朱砂和安宫牛黄丸基本不引起明显病理变化。同时发现甲基汞、氯化汞引起肾脏汞大量蓄积(高于朱砂50～200倍)。此外,甲基汞、氯化汞、亚砷酸钠和砷酸钠还诱导肾毒性相关基因(HO-1等)表达,而安宫牛黄丸、朱砂和雄黄则无影响[19]。同样,氯化汞和甲基汞引起肝脏病理损伤远较朱砂和安宫牛黄丸严重,并导致血清转氨酶升高和肝脏汞的大量蓄积(高于朱砂30～40倍)以及与肝脏毒性相关基因表达增高,表明甲基汞和氯化汞对小鼠肝毒性远远高于朱砂和安宫牛黄丸[20]。

2.3 其它含朱砂、雄黄中成药的研究

我们在对六神丸和牛黄解毒片的急性毒性研究中也发现,雄黄和含雄黄中成药的急性毒性远小于常见的砷酸钠和亚砷酸钠[17,18]。时京珍等[21,22]针对朱砂安神丸的细胞毒性,急性和长期毒性的研究也显示,朱砂及朱砂安神丸的细胞毒性,小鼠致死量,小鼠亚急性毒性和大鼠慢性肾毒性以及组织中汞的蓄积也远小于常见的氯化汞和甲基汞。

由此可见,安宫牛黄丸、朱砂和雄黄细胞毒性,急性和慢性毒性均远低于常见的汞、砷合物,提示汞、砷的毒性与其化学形式、价态以及在相应组织蓄积的程度密切相关[23,24],因此仅用总汞、总砷的含量评价含朱砂、雄黄中药的安全性是不科学的。

3 安宫牛黄丸及其所含朱砂和雄黄代谢的研究

朱砂、雄黄及含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸及其他中成药的肝肾毒性远小于常见的砷汞化合物,如氯化汞、甲基汞、亚砷酸钠、砷酸钠等,究其原因,可能与其代谢动力学特点有关。

3.1 安宫牛黄丸中雄黄和朱砂溶出度小,生物利用度低

汤毅珊等[25]将安宫牛黄散及复方中的单味药与雄黄混合后用人工胃液处理,发现可溶性砷含量均比单味雄黄在人工胃液中的溶出量低,提示安宫牛黄散组方中其他的药物可能具有抑制雄黄中可溶性砷溶出作用。王金华等[26]采用SD大鼠,在正常和脑缺血状态下发现安宫牛黄丸口服后,总砷量在血中最高,而汞主要分布在肾、血、脑等组织。梁国刚等[27]探讨了朱砂和雄黄各成分的溶解度对其在体内的吸收及药效、毒性的影响,认为朱砂和雄黄的主要成分硫化汞和硫化亚砷不溶于水和有机溶剂,难于吸收,其毒性很小。李珺等[28]检测了安宫牛黄丸,水飞朱砂和酸洗雄黄的溶出度并观察了安宫牛黄丸、硫化汞和硫化亚砷在W istar大鼠体内的砷汞排泄。结果发现水飞朱砂和酸洗雄黄在人工胃液和人工肠液中汞和砷的溶出量均低,安宫牛黄丸的砷汞溶出量更低;服用安宫牛黄丸大鼠尿中未检测到汞和砷,汞、砷主要经粪便排出,提示服用安宫牛黄丸后其中砷、汞生物利用度低。临床试验也显示：自愿受试者服用雄黄和牛黄解毒片后,尿砷排出量明显高于正常人,提示只有少量雄黄和牛黄解毒片中砷被吸收入血[29-30]。因此,不是毒物的摄入量,而是毒物的生物利用度及最终到达靶器官的量是其毒性的决定因素[31]。

3.2 安宫牛黄丸中朱砂和雄黄在组织中的分布和蓄积

Chuu等[32]观察了硫化汞在豚鼠体内的分布和毒性,发现连续口服硫化汞7 d后,在豚鼠血、肾、肝和小脑均见其分布,并引起视觉系统障碍和神经毒性,提示朱砂、硫化汞和甲基汞引起的毒性与其在相应组织蓄积的多少密切相关。我们的小鼠实验结果也表明急性染汞,汞主要蓄积于肝和肾,肝＞肾。慢性染汞,汞主要蓄积于肾、肝和脑,肾汞蓄积＞肝＞脑。朱砂、安宫牛黄丸在相应器官汞的蓄积远低于甲基汞和氯化汞[16,19,21,22]。砷的蓄积与汞有所不同,急性毒性实验中肝肾均出现砷蓄积[16-18],但雄黄和安宫牛黄丸在组织中的蓄积远低于亚砷酸钠[16-18]。在慢性试验中由于砷在体内排泄快,我们并未在肝肾组织中检测相应增高的砷蓄积[19-20]。从文献上看,慢性砷的毒性并不随其在相应组织蓄积的变化而变化[33-34]。

3.3 复方与朱砂、雄黄单用所致组织汞、砷的蓄积

尽管有文献报道安宫牛黄丸/散组方中,其它药物可能具有抑制朱砂和雄黄中可溶性汞、砷的溶出[25,28],但在动物实验中,口服安宫牛黄丸、硫化汞、硫化砷后大鼠粪便中汞、砷总排泄量无差异[28]。我们的实验表明复方较朱砂、雄黄单用所致组织汞、砷蓄积并不一致,如六神丸、安宫牛黄丸一次灌胃后在肝中的砷、汞含量高于单用雄黄或朱砂[16-17]。与之相反,一次口服安宫牛黄丸和朱砂安神丸后在肾脏的汞蓄积则低于单用朱砂[16,20]。由此可见,复方中的药物相互作用也是影响朱砂和雄黄在组织中蓄积的因素之一,在安宫牛黄丸毒性评价中应该加以考虑[23-24]。

4 展望

近年来,对安宫牛黄丸药理和毒理作用以及作用机制的研究取得了一些进展,但大多数研究工作只观察和测试一些宏观指标,更深一步的药理学与毒理学机制的研究不多,尚不足以给临床安全、合理用药提供科学依据。随着人们用药安全意识的提高,安宫牛黄丸中所含砷和汞等金属已经引起广泛关注,由于含朱砂和雄黄的名方尚有不少,且用途广,影响大,所以进一步阐明安宫牛黄丸的药理和毒理学机制迫在眉睫,科学的解析和规范安宫牛黄丸的组方,对含有朱砂和雄黄的其它中成药可产生示范作用。

4.1 中成药首先还是应考虑作为一个整体来研究

安宫牛黄丸作为中成药中久负盛名的药物,在我国治疗疾病已有几千年的历史,蕴含着完善和深遂的中医理论指导,不能单独用朱砂、雄黄来决定其药理与毒理活性。

4.2 辩证把握药物药效与毒性关系

“是药三分毒”,合理把握,突出其治疗作用,尽可能减少和避免毒性反应。在安宫牛黄丸研究中,不能为了与“国际接轨”而否定其中朱砂和雄黄的作用,也不能简单的因为其有毒而从组方中去除。

4.3 临床评价和长期用药的安全性

含雄黄、朱砂中成药安宫牛黄丸的药理和毒性应注重临床疗效和长期用药安全性。动物实验结果不能代表临床疗效,所以安宫牛黄丸的疗效和毒性的评价应以临床效果为主。临床上长期服用安宫牛黄丸的患者应将其血和尿中砷、汞及其代谢产物作为其潜在毒性指标进行监测。遵循循证医学原则,严格设计,合理对照,较大样本数的调查研究对正确评价安宫牛黄丸疗效和安全性至关重要。

[1] 潘华新,王培训,王宁生.安宫牛黄丸及其类方临床应用概况[J].新中医,2001,33(12)：64-66.

[2] 中国药典编撰委员会.中国药典[S].化工业出版社,2005.

[3] 李丹,李秀明,周宁.安宫牛黄丸的药理作用及临床新应用[J].海军医学杂志,2007,28(2)：179-181.

[4] 赵雍,曹春雨,王秀荣,等.含与不含朱砂和雄黄的安宫牛黄丸对大鼠局灶性脑缺血的影响[J].中国中西医结合杂志,2002,22(9)：684-686.

[5] 冯淑怡,孙建宁.安宫牛黄丸原方及简方对脑出血大鼠损伤保护作用的研究[J].现代生物医学进展,2007,7(4)：571-572.

[6] 方芳,孙建宁,杨莉,等.安宫牛黄丸全方及简方对大鼠脑出血损伤的影响[J].北京中医药大学学报,2007,30(9)：611-613.

[7] 付宪文,赵继宗,王硕.安宫牛黄丸对大鼠自发性脑出血模型血肿周围脑组织氨基酸表达及超微结构的影响研究[J].河北医学,2007,13(2)：224-225.

[8] 殷妮娜,孟运莲,王秋桂.安宫牛黄丸对大鼠脑出血后血肿周围脑组织含水量的影响[J].咸宁学院学报(医学版),2007,21(3)：196-199.

[9] 朱坤杰,孙建宁,张硕峰,等.安宫牛黄丸及重金属组分对内毒素脑损伤大鼠脑电图的影响[J].中成药,2008,30(2)：178.

[10] 朱坤杰,孙建宁,马长华,等.安宫牛黄丸及重金属组分对内毒素脑损伤大鼠大脑皮层单胺类递质的影响[J].中国中药杂志,2007,32(10)：949-953.

[11] 汤毅珊,林璞粤,欧卫平,等.安宫牛黄散的朱砂雄黄对感染性脑水肿大鼠乳酸脱氢酶及其同功酶的影响[J].中国中西医结合杂志,2005,25(5)：436-440.

[12] 林璞粤,汤毅珊,王宁生.安宫牛黄散中朱砂雄黄对外伤性脑水肿大鼠热休克蛋白、一氧化氮和炎症细胞因子的影响[J].中药材,2006,29：458-461.

[13] 张锋,陆远富,刘杰,等.雄黄是安宫牛黄丸抗细菌脂多糖诱导神经胶质细胞致炎作用的有效成分[J].中国中药杂志,2010,35(24)：3333-3338.

[14] 叶祖光,王金华,梁爱华,等.安宫牛黄丸及其简化方的药效学比较研究[J].中国中药杂志,2003,28(7)：636-639.

[15] Wu Q,Lu YF,Shi JZ,et al.Chem ical form ofmetals in traditional medicines underlines potential toxicity in cell cultures[J].J Ethnopharmacology,2011,Feb 1.[EPUB ahead of print].

[16] Lu YF,Yan JW,W u Q,et al.Realgar-and cinnabar-con taining An-Gong-Niu-Huang Wan(AGNH)ism uch less acutely toxic than sodium arsenite and mercuric chloride[J].Chem Biol Interact,2011,189(1-2)：134-140.

[17] Lu YF,Wu Q,Liang SX,et al.Cinnabar-con taining An-Gong-Niu-Huang Wan is much less hepatotoxic than common mercurials[J].Am JChin Med(submitted).

[18] 苗家伟,梁世霞,颜俊文,等.牛黄解毒片,雄黄与其它砷化物毒性的比较研究[J].毒理学,2011,待发表.

[19] Lu YF,W u Q,Yan JW,et al.Realgar,cinnabar and An-Gong-Niu-Huang Wan are much less chronically nephrotoxic than common arsenicals and mercurial[J].Exp Biol Med(May wood),2011,236(2)：233-239.

[20] Lu YF,Wu Q,Liang SX,et al.Comparasion of hepatotoxic effects of methyl mercury,mercuric chloride with cinnabar and cinnabar-containing An-Gong-Niu-Huang Wan[J].International the Journal of toxicology,2011,In press.

[21] 康峰,吴琨,何海洋,等.朱砂、朱砂安神丸与甲基汞、氯化汞的毒性对比研究[J].中国中药杂志,2010,35(4)：499-503.

[22] Shi JZ,Kang F,Wu Q,et al.Nephrotoxicity of mercuric chloride,methy lmercury and cinnabar-con taining Zhu-Sha-An-Shen-Wan in rats[J].Toxicol Lett.2011,200(3)：194-200.

[23] Liu J,Lu YF,Wu Q,et al.M ineral arsenicals in traditional medicines：Orpim ent,realgar,and arsenolite[J].JPharmacol Exp Ther,2008,326(12)：363-368.

[24] Liu J,Shi JZ,Yu LM,et al.Mercury in traditional medicines：is cinnabar toxicologically similar to common mercurials[J].Exp Biol Med,2008,233(7)：810-817.

[25] 汤毅珊,王宁生.安宫牛黄散中配伍药物对雄黄可溶性砷含量的影响[J].现代食品与药品,2006,16(3)：4-7.

[26] 王金华,叶祖光,梁爱华,等.安宫牛黄丸中汞、砷在正常和脑缺血模型大鼠体内的吸收与分布研究[J].中国中药杂志,2003,28(7)：639-642.

[27] 梁国刚,张启伟.朱砂、雄黄各成分的溶解度对其药效、毒副作用的影响[J].中国中药杂志,2002,27(5)：391-392.

[28] 李珺,袁倬斌,韩树波,等.安宫牛黄中汞、砷的存在形式及其吸收与排泄[J].首都医科大学学报,2006,27(5)：647-651.

[29] 铁步荣,乔旺忠,马忠明,等.人服用含雄黄中成药后尿中砷含量的动态研究[J].中国中药杂志,1992,17(5)：285.

[30] Koch I,Sylvester S,Lai VW,et al.Bioaccessibility and ex cretion of arsenic in Niu Huang Jie Du Pian pills[J].Toxicol Appl Pharmacol,2007,222(3)：357-364.

[31] Lehman-Mckeem an L.Paracelsusand formaldegyde 2010：the dose to the target organ makes the poison[J].Toxicol Sci,2010,116(2)：361-363.

[32] Chuu JJ,Young YH,Liu SH,et al.Neurotoxicity of mercury sulfide in the vestibular ocular reflex system of guinea pigs[J].Naunyn Schm iedebergs Arch Pharmacol,2001,364(3)：249-258.

[33] Xie Y,Trouba KJ,Liu J,et al.Biokinetics and sub chronic toxic effects of oral arsenite,arsenate,mono me thy larsonic acid,and dimethylarsinic acid in v-Ha-ras transgenic(Tg.AC)m ice[J].Environ Health Perspect.,2004,112(12)：1255-1263.

[34] Liu J,Liu Y,Goyer RA,et al.Metallothionein-I/II nullm ice aremore sensitive than wild-typemice to the hepatotoxic and nephrotoxic effects of chronic oralor injected inorganic arsenicals[J].Toxicol Sci.,2000,55(12)：460-467.