稳定表达Bcl-2的骨髓间充质干细胞载体的建立及对缺血性损伤保护作用的实验研究

何凡，何志义，李蕾，秦雪，邓淑敏，刘芳，阮杏林，冯程程

（1.中国医科大学 第一附属医院神经内科，沈阳 110001；2.沈阳军区总医院 神经内科，沈阳 110016）

近年来，干细胞移植作为一种不同于传统治疗的全新方法，能重塑受损的神经元通路和改善神经功能缺失而成为缺血性脑血管病治疗方面的研究热点［1］。用于治疗缺血性脑血管病的干细胞包括神经干细胞（neural stem cell，NSC）和骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSC）。神经干细胞来源于人的脑组织或人胚胎干细胞，受医学伦理限制，不适合自体移植。MSC更适合用于缺血性脑血管病的干细胞移植治疗［2～4］。而MSC移植入体内后的低成活率限制了其应用。Chen等［5］研究发现，MSC的神经细胞转化率在体外可高达80%，而在体内仅约为3%～10%，其原因虽然复杂，但主要是MSC移植至体内后，其自身发生凋亡所致。因此，如何减少其移植后凋亡的发生，提高MSC在体内的存活率及向神经细胞定向分化的能力是目前干细胞移植治疗脑缺血亟待解决的问题。

B cell lymphoma/leukemia gene 2（Bcl-2）是目前研究较为明确的抗凋亡基因。本研究拟采用慢病毒法将Bcl-2转导入MSC中，旨在增加MSC对Bcl-2的表达，提高MSC的存活率，为进一步解决MSC在体内凋亡率高的问题打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Gateway®BP ClonaseTMII Enzyme Mix、Gateway®LR ClonaseTMIIPlusEnzymeMix、LipofectamineTM2000、Opti-MEM I Reduced Serum Medium 均 购 自invitrogen公司。普TRI REAGENT购自美国MRC。RQ1 RNase-Free DNase购自美国Promega。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、GeneRulerTM100 bp DNA Ladder、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自美国 Fermentas公司。Puromycin、Polybrene、B-ME（2-巯基乙醇）购自Sigma公司。通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司。Neomycin、D/F12购自Gibco公司。F344大鼠间质干完全培养基、PBS、消化胰酶购自Cyagen公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。F344大鼠骨髓基质干细胞购自赛业（广州）生物科技有限公司。……