碱—酶法提取硫酸软骨素的工艺研究

吴枫楠

(吉林龙谷生物科技有限公司,吉林 132101)

碱—酶法提取硫酸软骨素的工艺研究

吴枫楠

(吉林龙谷生物科技有限公司,吉林 132101)

研究以猪软骨组织为原料,采用碱液提取和酶解相结合的方式提取硫酸软骨素。通过对影响碱液提取效率和酶解效果因素的研究,确定了碱液提取的最佳条件为:碱液的体积分数7.5%、提取温度为50℃、提取时间2 h、提取2次。酶解的最佳条件为:采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶1∶1(w∶v)、添加质量分数1.0%,p H值8、提取36 h。

硫酸软骨素;碱—酶法;木瓜蛋白酶;胰蛋白酶;猪软骨

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,简称CS)是存在于动物软骨组织中的多种酸性多糖的混合物,主要通过共价键与核心蛋白质相连,以蛋白聚糖的形式存在。具有多种同分异构体,根据硫酸基在半乳糖上的位置不同主要分为硫酸软骨素A(CSA)和硫酸软骨素B(CSC)[1]。

硫酸软骨素具有多种生物活性。由于硫酸软骨素具有降低血脂、抗病毒、提高免疫力、抗衰老等功能,被广泛应用于临床和生物医学中。

硫酸软骨素的提取方法主要有:高温高压、中性盐法、碱法、酶解法等,本文采用碱法和酶解法相结合的办法,着重对影响提取的关键步骤进行了研究,从而得到一条优化的生产途径。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

猪软骨组织(市售),活性炭,胰蛋白酶(活力1∶250),木瓜蛋白酶(活力1∶3 000),胃蛋白酶(活力1∶3 000)。

721型分光光度计:上海第三分析仪器厂; DHG-06型系列电热恒温鼓风干燥箱:武汉海声达仪器设备有限公司;HH-2数显恒温水浴锅:江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;LD4_2A型电动离心机:北京医用离心机厂;PHS—25型酸度计:上海雷磁仪器厂;抽滤机,JA2002电子天平。

1.2 试验方法

1.2.1 生产工艺流程

1.2.2 最佳工艺条件的确定方法

1)碱液提取条件的确定方法 由于硫酸软骨素通过共价键与核心蛋白相连接,以蛋白糖的形式存在,因此需以某种方法使共价键断裂,从而使硫酸软骨素释放出来,而碱液可较好的使共价键破裂,而且硫酸软骨素分子上的硫酸基比较稳定,在碱液作用下硫酸软骨素分子结构和分子质量一般不会发生变化,因此本实验采用加入碱液的办法提取硫酸软骨素。实验中以影响碱提效果的主要因素:碱液浓度,提取时间,提取次数,提取温度为试验因子,采用正交试验对提取工艺进行优化。

2)酶解条件的确定方法 为进一步提高硫酸软骨素的提取效果,同时提高产品的纯度,本实验采用外加蛋白酶的办法去除蛋白质。首先通过单因素试验确定最佳的分解酶,然后在酶确定的基础上,通过以影响酶解的主要因素:酶解温度、p H、酶的添加量、酶解时间为试验因子进行正交试验,对试验条件进行优化[3]。

3)活性炭吸附 酶解后酶解液p H值在8左右,滴加盐酸调节水解液p H值至6.5～7.0,温度控制在50℃,在搅拌下1∶1(W/V)加入颗粒状活性炭,搅拌吸附1h,然后用盐酸调节p H值为5.0～5.5,并加入2 g/dL量的氯化钠,升温近至(85℃左右)保温30 min,趁热用8层纱布过滤,滤液再用滤纸过滤两次得澄清的硫酸软骨素液。

4)纯化脱色 在经活性炭吸附后的溶液中加入乙醇,使乙醇体积分数达到65%～70%并静置过夜,次日可得胶状沉淀。所得沉淀用无水乙醇及丙酮各洗涤2～3次,然后过滤,滤渣置60～65℃的真空干燥箱中干燥,即得白色的硫酸软骨素粉[4]。

1.3 分析方法

蛋白质含量的测定:Folin-酚试剂法

产品总得率(%)=(干品硫酸软骨素的质量(g)/干燥猪软骨组织的质量(g)×100%[5]

游离氨基酸总量:茚三酮比色法[6]

2 结果与讨论

2.1 碱液提取条件的确定

准确称取9份50g∕份的软骨组织粉末于500 mL的烧杯中,在料液比为1∶2的基础上,以碱液浓度、提取时间、提取温度、提取次数4个因素进行正交试验(见表1,2)。

由表1,2可知:影响碱液提取的因素依次为: B>A>C>D,即碱液浓度对提取的影响最大,提取温度次之,而提取时间和提取次数对提取的影响相对较小。在料液比为1∶2时碱液提取的最佳组合为A2B2C2D1即:提取温度50℃、碱液体积分数7.5%、提取2次、提取时间24 h。

表1 碱液提取的因素水平表Tab.1 Factors and levels form of alaklin extraction

表2 碱液提取的正交试验表Tab.2 Orthogonal test table of alkali extraction

2.2 酶解条件的确定

2.2.1 酶种类的选择 硫酸软骨素与核心蛋白以共价键相连。碱液提取后,为进一步将蛋白质降解,使硫胺素释放出来,本实验采用各种不同的蛋白酶进行降解试验,从而确定最佳分解酶。准确称量4份50∕份的软骨组织粉末于500 mL的烧杯中,在p H值8.0、温度55℃、酶添加量为1.5%的情况下提取24 h,然后采用茚三酮与游离氨基酸的显色反应确定蛋白质的降解程度。

表3 酶种类的选择Tab.3 The selccfion of enzyme

由表3可知:在相同的作用条件下,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶作用效果最好,而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的作用效果次之且相似,胃蛋白酶的效果较差。因此本实验采用添加木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶(1∶1)的方法提取硫酸软骨素。

2.2.2 酶解条件的确定

在酶的种类确定的情况下,准确称取9份50g∕份的软骨组织粉末于500 mL的烧杯中,以影响酶解的四个因素:酶解温度、p H、添加量、酶解时间进行正交试验(见表4,5)。

由表4,5可知:各因素对酶解的影响依次为:A >B>C>D,即酶解的温度对酶解效果的影响最大,酶的添加量次之,酶解的p H和酶解时间影响相对较小。通过极差分析得最佳的酶解条件为A1B2C1D2,即酶解温度为45℃、混合酶添加量为1.0%、酶解p H为8、酶解时间36 h。

表4 酶解正交试验因素水平表Tab.4 Factors and levels from of enzyme hydrolysis

表5 酶解的正交试验表Tab.5 Orthogonal test of enzyme hydrolysis

3 结 语

1)本文研究以猪软骨组织为原料,通过预处理等工序制得软骨组织粉末,然后在不同的条件下进行提取试验,从而确定了碱液提取的最佳条件为:碱液体积分数7.5%、提取温度50℃、提取时间24 h,提取2次,酶解的最佳条件为:以木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶为降解酶,在温度为45℃、pH值为8、混合酶添加质量分数为1.0%的条件下酶解时间36 h。

2)最终产品呈白色、略带咸味、无臭,具有较强的吸水性,加热不凝结,易溶于水并形成粘稠溶液,不溶于酒精、乙醚、丙酮等有机溶剂。

3)主要检测结果为产品总得率为24.4%、硫酸软骨素质量分数92%、蛋白质质量分数2.35%、含水质量分数为8.72%、酸碱度为6.5。

[1]卢学根.羊软骨粘多糖的酶法提取工艺研究[J].食品工业科技,2007(10)184-185.

LU Xue-gen:The research of extraction technology of chondroitin sulfate mucopolysaccharides with enzymes from eggshell membrane[J].Science and Technology of Food Industry,2007(10)184-185.(in Chinese)

[2]武中会.碱液对牦牛软骨素提取硫酸软骨素工艺的影响[J].兽禽业,2008(6).

WU Zhong-hui.Influence on craft of the lye about extract the chs from yak’s cartilage[J].Livestock and Poultry Industry, 2008(6).(in Chinese)

[3]刘国庆,凌庆枝,孙军飞.蛋壳膜硫酸软骨素的提取工艺及其优化[J].食品科学,2007(9)283-285.

LIU Guo-qing,LING Qing-zhi,SUN Jun-fei.Optimization of extraction technology of chondroitin sulfate from eggshell membrane[J].Food Science,2007(9)283-285.(in Chinese)

[4]赵培城,高红林,朱顺达.猪硫酸软骨素提取工艺研究[J].食品科学,2004(4)14-17.

ZHAO Pei-cheng,GAO Hong-lin,ZHU Shun-da.Study on the extraction technology of the chondroitin sulfate of pig[J]. Food Science,2004(4)14-17.(in Chinese)

[5]舒坤贤,等.中华鲟硫酸软骨素提取工艺研究[J].食品工业科技,2006(3)151-155.28-30.

SHU Kun-xian.study on the extraction technology of chondroitin sulfate from aclpenser sinensis grdy cartilage[J].Science and Technology of Food Industry,2006(3)151-155.28-30.(in Chinese)

[6]大连轻工业学院,华南理工大学等合编[M].食品分析,中国轻工业出版社,2002.

(责任编辑:杨萌)

Extraction of Sulphuric Acid Cartilage Biotin by Alkali-Enzyme Process

WU Feng-nan
(Rongoo Jilin Biological Technology Co.Ltd.,Jilin 132101,China)

This aims of this study is to develop an efficient extraction process of chondroitin sulfate from pig cartilage by Alkali-enzyme hydrolysis.For this,the optimum conditions were determined and listed as follows:Density 7.5%,Temperature 50℃,Time 2 h,two times.the optimum conditions to extracted enzyme are as follow:Mixed enzyme with quince protein enzyme and trypsin(1∶1)、Additive Quantity:1.0%,p H=8、Extracting 36 h.

chondroitin sulfate,alkali-enzyme method,quince protein enzyme,trypsin,pig cartilage

Q 81

:A

1673-1689(2010)01-0081-03

2008-11-04

吴枫楠(1982-),男,蒙古族人,吉林人,助理工程师,主要从事生物技术研究及新产品研发工作。Email:wunan8866@163.com