甲状腺激素受体在大菱鲆组织细胞中的表达及其与甲状腺激素的关系

田 娟,施志仪

(上海海洋大学生物技术研究中心,上海201306)

甲状腺激素受体在大菱鲆组织细胞中的表达及其与甲状腺激素的关系

田 娟,施志仪＊＊

(上海海洋大学生物技术研究中心,上海201306)

为了探讨甲状腺激素受体在大菱鲆(Scophthalmus maximus)体内的表达情况及在细胞水平三碘甲状腺原氨酸(T3)对甲状腺激素受体(TR)表达量的影响,利用荧光定量PCR法检测了大菱鲆8个组织中甲状腺激素受体TRαA、TRβ的表达量,并设计了0,50,75,100和200 nmol/L 5个不同浓度的T3处理大菱鲆肾细胞(SMKC),采用实时荧光定量PCR法测定T3处理后甲状腺激素受体TRαA、TRβ的表达量。结果表明,甲状腺激素受体TRαA、TRβ在大菱鲆不同组织中的表达量各不相同,但两者均在肾脏组织中表达量最高。在不同浓度T3处理后甲状腺激素受体的表达量存在明显的差异,在低浓度条件下,TRαA、TRβmRNA的表达量增加,当T3浓度达到100 nmol/L时,TRαA、TRβmRNA表达量明显降低,说明50,75 nmol/L的T3能够引起细胞中甲状腺激素受体TRαA、TRβ表达量的增加,而100,200 nmol/L的T3会相对抑制细胞中甲状腺激素受体TRαA、TRβ的表达量。

大菱鲆;三碘甲状腺氨酸(T3);甲状腺激素受体(TR);大菱鲆肾细胞(SMKC);实时荧光定量PCR

脊椎动物甲状腺合成和分泌2种甲状腺激素:三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4),它们在脊椎动物的生长和代谢过程中起着重要的作用。日本学者Inui等[1]研究发现,用外源性甲状腺素T4处理牙鲆后期仔鱼,能够促进其提前变态并提高变态成活率,用抑制甲状腺激素合成的硫脲处理,则使牙鲆后期仔鱼变态停滞。唐啸尘等[2]在用甲状腺素T4分别处理变态前期和变态高峰期的斜带石斑鱼仔鱼时发现,高剂量与低剂量的T4对处于不同发育阶段的斜带石斑鱼仔鱼的影响作用各有差异。Miwa S等[3]对牙鲆变态发育过程研究发现,甲状腺激素T3与T4生物学效应相似,并且T3相对T4具有更强的生物活性。

业已表明,甲状腺激素产生的生物学效应都是由甲状腺激素受体介导[4-5],甲状腺激素通过与其受体结合,调节相关基因的表达,以发挥其生物学作用。Yamano等[6-7]克隆了牙鲆甲状腺激素受体(TRα和TRβ)基因,其中α又包括A型和B型,这二者和β型具有一定的差别,β型又分为2种序列相近的1和2亚型,二者序列高度相似,难以区分。在牙鲆受精卵中TRαA水平比较低,孵化后TRαA水平有所提高,变态前达到高峰期的一半,在变态高峰期达到最高水平,变态后又恢复较低水平[8]。施志仪等[9]研究发现在牙鲆变态发育期间,硫脲处理组与同日龄正常组相比,甲状腺激素受体TRαA的表达水平增高;而甲状腺激素处理组与同日龄正常组相比,甲状腺激素受体TRαA的表达水平降低,表明甲状腺素对变态期牙鲆TRαA基因表达可能有下降调节作用。Dace等[10]研究发现外源激素T3能诱导哺乳动物TRα1、TRβ2受体蛋白的快速降解,但不能诱导TRα2受体蛋白的降解。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)属于鲽形目(Pleuronectiformes)鲆科(Bothidae)菱鲆属(Scophthalmus),在早期阶段与牙鲆有相同的右眼移位变态发育过程,从生物进化树中分析也与牙鲆的亲缘关系比较近。本研究以大菱鲆8个不同的组织及其肾细胞为材料,从体内外研究甲状腺激素受体的表达及其与三碘甲状腺原氨酸(T3)的关系,为揭示鲆鲽鱼类变态发育这一特殊生命现象以及激素与受体的关系提供新的资料。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料与试剂

实验用大菱鲆成鱼购于上海铜川路水产市场,在实验室暂养;大菱鲆肾细胞(SMKC)由中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林老师惠赠;DMEM培养基粉末、胎牛血清、Hepes、成纤维细胞生长因子(bFGF)购于Invitrogen;三碘甲状腺原氨酸(T3)购于Sigma公司;TRIzol、RNasin Ribonuclease Inhibitor、SY BR PremixEx Taq购于TAKARA公司;M-MLV逆转录酶购于Promage公司;

1.2 方法

1.2.1 大菱鲆各组织总RNA的提取与cDNA的合成

用手术剪准确剪取大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织,生理盐水洗净后用TRizol试剂法提取8个组织的总RNA,分光光度计检测其OD值,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,按Promage逆转录酶说明书反转录合成cDNA。

1.2.2 细胞培养及药物处理 SMKC用DMEM培养基培养,培养基中含15%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL、bFGF 2 ng/mL、Hepes 20 mmol/L,置于24℃培养箱中培养。细胞长满整瓶后用0.25%胰酶消化传入六孔板中,待细胞长满孔板更换新鲜培养基,同时加入甲状腺激素T3溶液作用12 h,参照Dace等[10]对GC细胞的实验,设计了T3的处理浓度分别为0,50,75,100和200 nmol/L,重复3次。

1.2.3 总RNA的提取与cDNA的合成 PBS溶液冲洗细胞2次后用TRIzol法提取细胞的总RNA,分光光度计检测其OD值,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,按Promage逆转录酶说明书反转录合成cDNA。

1.2.4 引物设计 参照GenBank中大菱鲆TRαA (AF302253)、TRβ(AF302254)和β-actin(A Y008305)的相关序列,分别设计了各基因的特异性引物(见表1)。

表1 实时荧光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for Real-time quantitative PCR analysis

1.2.5 常规PCR扩增 PCR反应体系为:10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL、dNTP 2μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL、5 U/μL的TaqDNA酶0.2μL、反转录产物0.5μL,补充ddH2O至25μL。反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35个循环;72℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物回收纯化后测序检测。

1.2.6 实时荧光定量PCR

1.2.6.1 标准曲线的建立 样品cDNA进行10倍系列稀释,以稀释后的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,每个模板重复2次。反应体系为:SYBR Premix ExTaq(2×)10μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、cDNA模板2μL,加ddH2O至20μL。反应条件为:(1)95℃预变性1 min;(2)95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s,共40个循环;(3)融解曲线制备:55～90℃,每0.5℃收集1次荧光信号,共71个循环。

1.2.6.2 目的基因的定量 对样品cDNA进行目的基因实时荧光定量PCR扩增,反应体系及反应条件同

1.2.6.1 ,每个样品重复3次。

1.2.6.3 数据分析 根据实时荧光定量PCR结果,以β-actin为参照基因,根据目的基因及β-actin的Ct值,按照2-ΔΔCt法计算目的基因的表达情况。运用SPSS统计软件进行多重比较分析差异显著性,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大菱鲆各组织及SM KC中TRαA、TRβ的表达情况

对大菱鲆8个不同组织及SM KC进行了TRαA和TRβ的扩增,发现8个不同组织和SM KC中均检测到TRαA、TRβ基因的表达(见图1)。

图1 SMKC及大菱鲆8个组织中TRαA和TRβ的表达情况Fig.1 The expression of TRαA and TRβin SMKC and eight tissues ofScophthatmus maximus

2.2 大菱鲆不同组织中甲状腺激素受体TRαA、TRβ的表达

对大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织的cDNA进行荧光定量PCR扩增,根据实时荧光定量PCR结果,以β-actin为参照基因,根据目的基因及β-actin的Ct值,按照2-ΔΔCt法计算甲状腺激素受体TRαA、TRβ在大菱鲆8个组织中的表达情况。从结果看出,甲状腺激素受体TRαA、TRβ在大菱鲆不同组织中的表达量有明显的差异(见图2、图3)。

图2 大菱鲆不同组织中TRαA mRNA的表达量差异Fig.2 The expression of TRαA mRNA in different tissues ofScophthatmus maximus

图3 大菱鲆不同组织中TRβmRNA表达量的差异Fig.3 The expression of TRβmRNA in different tissues ofScophthatmus maximus

从大菱鲆8个不同组织中甲状腺激素受体TRαA、TRβ基因的表达量情况看来,肾脏组织中甲状腺激素受体TRαA、TRβ基因的表达量均为最高,其次是肝脏组织中。以肠组织中的TRαA mRNA表达量为1个单位,肾脏中TRαA mRNA的表达量是肠组织中23.1倍,肝脏组织中的表达量是肠组织中的16.7倍,脑组织中表达量是肠组织中4倍,鳃组织中的表达量是肠组织中的2.8倍,心脏组织中的表达量是肠组织中的1.4倍,脾脏组织中表达量是肠组织中的1.1倍,肌肉组织中TRαA mRNA的表达量最少,只有肠组织中的0.7倍。以肠组织中的TRβmRNA表达量为1个单位,肾脏中TRβmRNA的表达量是肠组织中5.7倍,肝脏组织中的表达量是肠组织中的1.4倍,鳃组织中的表达量是肠组织中的1.2倍,心脏组织中的表达量是肠组织中的0.99倍,脾脏组织中表达量是肠组织中的0.7倍,肌肉组织中表达量是肠组织中0.6倍,脑组织中TRβmRNA的表达量最少,是肠组织中的0.2倍。由此看来,甲状腺激素受体TRαA、TRβ在大菱鲆成鱼组织中的表达量具有组织特异性。

2.3 T3处理对TRαA mRNA表达量的影响

根据实时荧光定量PCR结果,以β-actin为参照基因,根据目的基因及β-actin的Ct值,按照2-ΔΔCt法计算不同浓度T3处理对TRαA mRNA表达量的影响。结果表明,各浓度处理后与正常组相比变化量明显。

结果显示,在T3浓度0～200 nmol/L范围内,低浓度时,与正常组比较TRαA mRNA表达量明显上调,T3浓度为50 nmol/L时,TRαA mRNA的表达量(P=0.007<0.05)是正常组的7.9倍;T3浓度为75 nmol/L时,TRαA mRNA表达量(P=0.034<0.05)达到最大值,表达量是正常组的11.4倍;当T3浓度为100 nmol/L时,TRαA mRNA表达量(P=0.043< 0.05)降低至正常组的3.2倍;T3浓度为200 nmol/L时,TRαA mRNA表达量(P=0.013<0.05)也为正常组的3.2倍(见图4)。

图4 TRαA mRNA的相对表达量(不同字母间差异显著,P<0.05)ig.4 The relative expression of TRαA mRNA(Significant difference between the different letters,P<0.05)

2.4 T3处理对TRβmRNA表达量的影响

T3处理后TRβmRNA表达量与正常组比较也有显著差异。TRβmRNA表达量的变化趋势与TRβ mRNA表达量的变化趋势相同(见图5)。当T3浓度为50 nmol/L时,TRβmRNA的表达量(P=0.003< 0.05)是正常组的5.8倍;T3浓度为75 nmol/L时, TRβmRNA的表达量(P=0.006<0.05)是正常组的6倍;而当T3浓度为100 nmol/L时,TRαA mRNA表达量(P=0.002<0.05)降至正常组的2倍;T3浓度为200 nmol/L时,TRαA mRNA表达量(P=0.012< 0.05)为正常组的1.7倍。

图5 TRβmRNA的相对表达量(不同字母间差异显著,P<0.05)Fig.5 The relative expression of TRβmRNA(Significant difference between the different letters,P<0.05)

3 讨论

甲状腺激素在鱼类代谢活动、生殖、胚胎发育、仔鱼生长、变态及其存活等方面起着重要作用[11],而甲状腺激素产生的生物作用是通过TR介导的[1-2]。许多文献表明甲状腺激素诱导牙鲆变态是通过与TRs结合推动特异基因转录的结果[8,12-13]。甲状腺激素进入细胞核后与受体结合,激活受体,并使之结合于基因的一段特定的DNA序列,即甲状腺应答因子,从而正向或反向调节特定基因的转录和表达[14-15]。

在哺乳动物中,TR有TRα和TRβ2种亚型,其中TRα有TRα1和TRα2的2种主要的异形体,TRβ有TRβ1和TRβ2 2种异形体[16]。其中TRа1、TRβ1和TRβ2可结合T3,为功能性受体[17]。牙鲆甲状腺激素受体基因序列与哺乳类和两栖类动物的甲状腺激素受体基因具有高度同源性[6-7]。Yamano通过RT-PCR和原位杂交实验,发现TR亚型在牙鲆变态期间(TRαA、TRαB和TRβ1、TRβ2)基因表达具有组织特异性和时间特异性[18]。Madhu S.Malo等在Caco-2细胞中检测出2种甲状腺激素受体TRα1、TRβ1,其中TRα1基因和蛋白表达量明显高于TRβ1占主导地位[19]。本实验中发现,在大菱鲆肾细胞(SM KC)中表达TRαA、TRβ基因,但是未检测到TRαB基因的表达。从大菱鲆8个组织中甲状腺激素受体TRαA、TRβ的表达量差异来看,TRαA、TRβ在大菱鲆成鱼组织中的表达量具有组织特异性。

为了进一步研究甲状腺素与其受体之间的关系,取组织中表达量最高的肾细胞(SM KC)进行体外培养,用不同浓度的三碘甲状腺原氨酸(T3)处理,观察受体表达情况。研究表明,T3对甲状腺激素受体存在一定的调控作用。在50 nmol/L的T3处理后,受体表达量较未处理组的表达量增加;当T3浓度达到75 nmol/L时,受体的表达量达到最高;但当T3浓度达到100 nmol/L时,受体的表达量又相应的降低,这表明,低浓度的T3能够引起受体表达量的增加,而高浓度的T3会相对抑制受体的表达。T3对TRβmRNA的表达量也有相似的调控,但两者又有所差别,在T3浓度为50 nmol/L时,TRαA mRNA的表达量是正常组的7.9倍,TRβmRNA的表达量是正常组的5.8倍;T3浓度为75 nmol/L时,TRαA mRNA、TRβmRNA表达量达到最大值,TRαA mRNA表达量是正常组的11.4倍,TRβmRNA的表达量是正常组的6倍。这说明外源性甲状腺激素T3对TRαA mRNA表达的影响作用较对TRβmRNA的影响作用强。

在高浓度的T3作用下,肾细胞中的甲状腺激素受体TRαA、TRβ的表达量相对降低,这一结果与施志仪等在牙鲆仔鱼体内试验的的结果相似,在用高浓度甲状腺素T4处理牙鲆仔鱼后与正常组比较,发现处理组的TRαA mRNA的表达降低[9]。关于这一现象, Dace[10]曾有过实验的说明,他们通过细胞转染和Western blotting研究发现外源激素T3能诱导哺乳动物TRα1、TRβ2受体蛋白的快速降解,但不能诱导TRα2受体蛋白的降解。研究表明蛋白酶介导的降解对于甲状腺激素受体的转录活性起着关键作用。在哺乳动物中,甲状腺激素T3结合到甲状腺激素受体上,能诱导甲状腺激素受体降解,此降解过程经蛋白酶体路线进行,同时可受到泛素蛋白-蛋白酶体降解路线中的1种选择性抑制剂Lactacystin的抑制,在蛋白酶体抑制剂存在的情况下,甲状腺素β1受体水平升高,而T3依赖的转录活性和基因表达会受到抑制。这表明蛋白酶体调控的甲状腺激素受体降解对甲状腺激素受体的转录激活作用着重要的调控功能。由此推测甲状腺激素的作用机制可能是T3与受体结合,导致了激素-结合受体构型的改变,易于蛋白酶体的降解,生成可与共激活因子结合的活性区(可能是AF-2)从而激活靶基因的转录。在鲆鲽鱼类中的甲状腺激素受体的降低也可能与这种机制有关,但还需要更多研究加以证实。

综上所述,甲状腺激素受体在大菱鲆成鱼8个组织中均有表达,但其表达量却有明显的差异,具有组织特异性。在肾细胞中的研究表明三碘甲状腺原氨酸(T3)对甲状腺激素受体TRαA和TRβ都有一定的调控作用,低浓度的T3增加受体的表达量,而高浓度的T3会相对抑制受体的表达,其调控的分子机制有待进一步的研究。

致谢:在本研究中,中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林研究员在细胞培养中给予了帮助,特此感谢!

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Abstract: In order to study the expression of thyroid hormone receptor(TR)gene inScophthatmus maximusand the effects of triiodothyronine(T3)on the expression of thyroid hormone receptor(TR) gene at the cellular level,Real-time fluorescent quantitative PCR was applied to detect the expression of TRαA mRNA and TRβmRNA in eight different tissues ofScophthatmus maximusand the SM KC that was treated by T3 in five different concentrations(0,50,75,100 and 200 nmol/L).The results showed that the expression of TRαA mRNA and TRβmRNA were various in the different tissues ofScophthatmus maximus.Both TRαA mRNA and TRβmRNA showed their highest expression in the kidney tissue. There was a significant difference on the expression of thyroid hormone receptor(TR)after treated by T3 using different concentrations.The expression of TRαA and TRβmRNA were increased in low concentration.However,the TRαA and TRβmRNA expression decreased significantly when the concentration of T3 up to 100nM.It was shown that 50nM and 75nM of T3 can increase the TRαA and TRβmRNA expression,while 100nM and 200nM of T3 can inhibit their expression relatively.

Key words: Scophthalmus maximus;triiodothyronine(T3);thyroid hormone receptor(TR);SMKC; real-time fluorescence quantitative PCR

责任编辑 于 卫

The Expression of Thyroid Hormone Receptor in the Tissues and Cells of Scophthatmus maximus and Relationship Between It and Thyroid Hormone

TIAN Juan,SHI Zhi-Yi
(Biotechnology Research Center,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

S917;Q291

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-105-05

国家自然科学基金项目(30571420);国家教育部博士项目基金(20040264001);上海市重点学科水生生物学建设项目(S3070)资助

2010-04-12;

2010-06-12

田 娟(1984-),女,硕士生,研究方向:鱼类发育生物学。E-mail:tian_hjuan@163.com

Tel:021-61900051;E-mail:zyshi@shou.edu.cn