砂生小树状霉与盐水小树状霉分类地位初探

孙开明,唐学玺,张天宇,李 伟,＊＊

(1.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;2.山东农业大学植物病理学系,山东泰安271018)

砂生小树状霉与盐水小树状霉分类地位初探

孙开明1,唐学玺1,张天宇2,李 伟1,2＊＊

(1.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003;2.山东农业大学植物病理学系,山东泰安271018)

从海带幼孢子体上分离获得1株海洋真菌(编号OUCMBI080016),根据形态学特征鉴定为砂生小树状霉(Dendryphiella arenaria)为中国新记录种。同时,为确定D.arenaria和D.salina的分类地位,从GenBank数据库选取7株齿梗孢属(Scolecobasidium)和10株小树状霉属(Dendry phiella)菌株(其中7株分离自海洋环境),进行ITS序列的系统发育分析。Kimura双参数距离、歧异指数及MP树分析显示,Solecobasidium和Dendryphiella存在较大的遗传进化差异,研究结果支持D.arenaria和D.salina属于Dendryphiella。

海洋真菌;Dendryphiella arenaria;Scolecobasium;ITS

小树状霉属Dendry phiellaBubak&Ranogevic建立于1914年,模式种为葡酒色小树状霉Dendry phiella visona(Berk.&M.A.Curt.)Reisinger[1]。此属目前共报道13种[2],国内仅记录1种:构树小树状霉Dendry phiella broussonetiaeY.L.Guo&Z.Y. Zhang[3]。该属中的砂生小树状霉Dendry phiella arenariaNicot和盐水小树状霉Dendry phiella salina (G.K.Sutherl.)Pugh&Nicot被认为是专性海洋真菌。这两种真菌在世界各地分布广泛,作为分解者存在于海洋环境中[4]。前者通常分离于海砂中,后者则常见于腐烂的海藻和海草上[1,5-7]。这2种海洋真菌的生境并不仅局限于海砂与海草或海藻,Koehn和Garrison[8]从红树植物A vicennia germinans上分离到D. arenaria,Gessner和Goos[9]从米草属植物S partina alternif loras上分离到上述2种海洋真菌。Edwards等[10]和Edison等[11]分别讨论了D.arenaria和D.salina对不同氮源和碳源的利用情况,揭示了D.arenaria和D.salina在海洋碳循环与氮循环的过程中可能扮演着重要的角色。

Dendry phiella中海洋真菌D.arenaria和D. salina的分类地位一直存在争议。Ellis[12]将这两种真菌划归到齿梗孢属Scolecobasidium中,荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)将D.arenaria和D.salina作为砂生齿梗孢Scolecobasidium arenarium和盐水齿梗孢Scolecobasidium salinum的异名。目前,一些研究从形态学的角度分析了D.arenaria和D.salina与Scolecobasidium的不同[1,5-7],但都没有对其进行系统发育分析。

作者从烟台海带养殖厂的日本真海带L aminaria japonica幼孢子体表面分离获得了1株海洋真菌,基于其形态学特征,将该菌株鉴定为D.arenaria。同时,为探讨D.arenaria和D.salina的分类学地位,基于ITS区序列,本文将其与Scolecobasidium物种的进化关系进行了详细的分析。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离

在超净工作台内,用无菌海水将海带幼孢子体冲洗干净,剪成约2 cm×1 cm的小块,表面贴于海水PDA培养基(含1 g/L的青霉素G和链霉素混合液)上,于20℃暗处培养1～2 d。从培养基中移除孢子体小块,继续在上述条件下培养至有少量菌丝出现。挑取菌落边缘少量菌丝转接至新的PDA培养基上进行纯化,将纯化的单一菌株斜面保种并编号。

1.2 形态学鉴定

纯化后的菌株在PDA培养基上培养1周,体视镜下挑取少量菌丝体于载玻片上,以乳酚油为浮载剂。玻片于显微镜下拍照,所有显微照片均经过best fit equalization处理,Image-Pro plus 6.0测量孢子大小。

1.3 分子生物学鉴定与进化分析

1.3.1 DNA提取与ITS片段扩增 DNA提取采用CTAB法[13]。扩增引物选用ITS1和ITS4,扩增片段为ITS1,ITS2和5.8S rDNA[14]。PCR体系为50μL:模板2μL,上游引物ITS1(25μmol/L)和下游引物ITS4(25μmol/L)各1μL,dNTP(2.5μmol/L)4μL, 10×Buffer(含Mg2+)5μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL,双蒸水定容。扩增程序为:首先,94℃预变性2 min;然后,94℃变性1 min,55℃退火1.5 min,72℃延伸2.5 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物直接送上海生工生物工程技术有服务限公司纯化后测序。

1.3.2 数据处理与分析 将获得的序列与GenBank数据库中已知序列进行比较,选取相似度最高的序列。同时,从GenBank中下载7株Scolecobasidium与10株Dendry phiella的ITS序列,以Clustal X 1.83进行多序列比对,Bioedit对序列进行手动编辑后,以Mega 4.0中最简约法(Maximum parsimony,MP)构建系统发育树,自展法(Bootstrap)1000次重复。利用Mega 4.0进行数据分析:基于Kimura双参数模型计算别计算遗传距离,以歧异指数(disparity index)来检测碱基替换同质性[15]。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

砂生小树状霉 中国新记录种(见图1)

Dendry phiella arenariaNicot,Rev Mycol.Paris 23:93,1958

≡Scolecobasidium arenarium(Nicot)M.B.Ellis,More Dematiaceous Hy phomycetes(Kew):194, 1976.

图1 砂生小树状霉Fig.1 Dendryphiella arenaria

纯化后单一菌株在海水PDA上20℃暗培养5 d,菌落呈浅黄绿色,直径为3～4 cm;菌丝体部分表生,部分埋生;气生菌丝较发达;菌丝淡褐色或无色,有隔膜;分生孢子梗内壁芽生式产孢,阔线型,顶侧生,长15～31μm,宽2～3μm,淡褐色,简单或二叉分支,分支处间隔15～21μm,顶端膨大,0-1横隔膜;产孢细胞顶生,亚球形,3～4μm;分生孢子单生,顶侧生,10～29μm×5～7 μm,浅褐色或近无色,光滑,棒状,椭圆形或长椭圆形,直立或稍有弯曲,0～3横隔,多平行,偶见4～6个横隔膜,横隔膜处孢子稍微缢缩或不缢缩,偶有倾斜,分生孢子基部有一个明显的脐突。

研究菌株:OUCMBI080016,分离自烟台海带养殖厂的日本真海带幼孢子体表面,保存于中国海洋大学生态学实验室。

2.2 基于ITS区序列的系统发育分析

通过序列比对,所得菌株ITS区序列与D.arenariaCBS 181.58(Genbank登录号为DQ411539)菌株相似度达99%。经Clustal X 1.83比对与Bioedit调整后,所得菌株ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列与D.arenariaCBS 181.58仅存在1个缺失位点,可认为是同一种菌,GenBank登录号为GU395991。共有592个位点用于系统发育分析。其中可变位点(Variable sites)362个,简约信息位点(Parsimony informative sites)263个,保守位点(Conserved sites)219个。进化树树长(Tree length)为755,简约信息位点一致性指数(Consistency index,CI)为0.751987,保留指数(Reten-tion index,RI)为0.863993,调整保留指数(Rescaled consistency index,RCI)为0.649712。从进化树(见图2)上可以看出,以点状小球壳菌Mycosphaerella punctif ormis为外群(outgroup),Dendry phiella(Ⅰ)和Scolecobasidium(Ⅱ)发展成2个独立的类群,Dendryphiella属的模式种D.vinosa首先分化出来,但支持率不高,仅为67%。海洋真菌D.arenaria和D.salina聚合为1枝,支持率为99%。Scolecobasidium中大部分物种的分支长度要长于Dendry phiella。

图2 Dendry phiella和Scolecobasidium属ITS序列的MP进化树Fig.2 Maximum parsimony(MP)tree based on the ITS region fromDendryphiellaandScolecobasidium

Dendry phiella中各个碱基所占比例相近,T含量略高,G+C含量为46.8%。Scolecobasidium的G+C含量为54.5%,G含量达到30.1%,远高于Dendryphiella;T含量仅为19.6%,远低于Dendry phiella (见表1)。

表1 Dendryphiella和Scolecobasidium碱基组成Table 1 The base composition ofDendry phiella andScolecobasidium

基于Kimura双参数模型计算Dendry phiella和Scolecobasidium间的遗传距离,结果表明:D.arenaria和D.salina各菌株间遗传距离为0.000～0.013,与Dendry phiellasp.和小麦小树状霉D.triticicola间的遗传距离为0.089～0.095,与D.vinosa间的遗传距离为0.397～0.407,与Scolecobasidium各菌株间的遗传距离为为0.491～0.620,Dendry phiella和Scolecobasidium间的平均遗传距离为0.533。

以歧异指数检测碱基替换同质性,蒙特卡罗法进行显著性检验,结果表明:Dendry phiella属内歧异指数为0.000～0.006,Scolecobasidium属内歧异指数为0.000～1.565,两属属间歧异指数为0.362～6.822。海洋真菌D.arenaria和D.salina与Scolecobasidium属间歧异指数为1.143～6.822,碱基替换格局差异显著(P<0.05)。

3 讨论

分生孢子大小以及隔膜数是区分2种海洋Dendryphiella真菌主要的形态分类特征[4]。D.arenaria分生孢子通常具有1～3个横隔膜,大小为9～20×4～6μm, D.salina分生孢子隔膜数一般为2～9个,大小为14～75×6～10μm[1,6]。同时,Jones等[6]指出,随培养条件的变化,该2种海洋真菌的分生孢子大小是可变的;Nicot[16]也指出在含有3.4%～20%的氯化钠浓度的培养基上,D.arenaria分生孢子的隔膜数可达到5个。作者分离菌株的分生孢子,大小略大于上述描述;隔膜数最多为4个,与Nicot所描述的结果类似。Eills[12]曾将这2种真菌划入Scolecobasidium,但并未得到Jones及Kohlmeyer等人的认可[1,5-7],因为Scolecobasidium的产孢细胞属于全壁芽生式产孢,并且具有齿突,而D.arenaria和D.salina的产孢细胞属于内壁芽生式产孢,缺少齿突。Jones等[6]通过扫描电镜观察,没有发现D.salina的产孢细胞上具有类似Scolecobasidium产孢细胞的齿突,作者也未在对象菌株的产孢细胞上发现类似Scolecobasidium的齿突。

目前,很多研究都采用遗传距离作为物种分化的判据之一[17-18]。歧异指数可以用来鉴定那些进化上存在本质不同的基因和谱系,是用来衡量碱基替换同质性的1个指标[19]。在本研究中,海洋真菌D.arenaria和D.salina与Scolecobasidium供试菌株间的遗传距离大于Dendry phiella属内菌株遗传距离,且与Scolecobasidium的碱基替换格局存在显著差异。综合两属真菌I TS的遗传距离和碱基替换格局,认为该2种海洋真菌无法划入Scolecobasidium中。

Jones等[6]基于SSU+LSU序列构建ML树,认为Dendry phiella的模式种D.vinosa与D.arenaria和D.salina的进化距离较远。他们在比较ITS区序列时,未包括D.vinosa。本研究基于ITS区序列,以MP法构建Dendry phiella和Scolecobasidium进化树,将D.vinosa的ITS区序列包括在内。通过比较,发现与Jones等的研究结果类似,D.vinosa的ITS进化距离与D.arenaria和D.salina有较大的差异,前者进化树分支长度短于后2种。一般认为,进化树分支的长度与相邻两结点类群的进化程度有关,分支越长,序列分化程度越大[20]。与D.vinosa相比,D. arenaria和D.salina的ITS区序列进化程度更高。同时,Jones等[6]还发现D.arenaria和D.salina与格孢腔菌属Pleospora和匍柄霉属Stemphylium的亲缘关系较近,他们认为这2种海洋真菌可能是一个新属。但作者在比较Dendry phiella属内真菌遗传距离时发现,海洋真菌D.arenaria和D.salina供试菌株虽与D.vinosa的遗传距离较大,但与Dendry phiella sp.以及D.triticicola的遗传距离很小,无法将它们完全从Dendry phiella中分离出来。

综合形态学特征和ITS区序列分析结果,本文将编号为OUCMBI080016的菌株鉴定为Dendry phiella arenaria,并支持D.arenaria和D.salina归为Dendry phiella属物种的分类地位。

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Abstract: One strain of marine fungi(No.OUCMBI080016)was isolated from the surface of young sporphytes ofL aminaria japonicaand identified asDendry phiella arenariaaccording to the morphological characteristics,which is a newly recorded species in China.To determine the taxonomic position ofD. arenariaandD.salina,the ITS sequences of seven strains in the genus ofScolecobasidiumand ten strains ofDendry phiellagenus(including seven strains from marine environment)were downloaded from Gen-Bank database for further phylogenetic analysis.Analysis of Kimura-2 parameters distance,disparity index and maximum parsimony tree(MP tree)indicated that the evolutionary lineage of marine species of Dendry phiella(D.arenariaandD.salina)is distantly related toScolecobasidium,which supported that D.arenariaandD.salinabelong toDendry phiella.

Key words: marine fungi;Dendry phiella arenaria;Scolecobasidium;ITS

责任编辑 于 卫

The Primary Study on the Taxonomic Position of Dendryphiella arenaria and D.salina

SUN Kai-Ming1,TAN G Xue-Xi1,ZHANG Tian-Yu2,LI Wei1,2
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Department of Plant Pathology, Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China)

Q93

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-147-05

山东省优秀中青年科学家奖励基金(BS2009NY018);青岛市科技计划基础研究项目(09-1-3-13-jch);中国博士后基金(20080441151);中国科学院实验海洋生物学重点实验室开放基金资助

2010-04-07;

2010-06-12

孙开明(1985-),男,硕士生,主要从事海洋生态学研究。E-mail:skm-123@163.com

E-mail:liwei01@ouc.edu.cn