木瓜蛋白酶提取仿刺参消化道多糖

陈 涛 ，张 健 ，王茂剑 ,*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 200000；2.山东省海洋水产研究所，山东 烟台 264006)

木瓜蛋白酶提取仿刺参消化道多糖

陈 涛1,2，张 健2，王茂剑2,*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 200000；2.山东省海洋水产研究所，山东 烟台 264006)

采用酶解法提取仿刺参消化道多糖并进行初步性质测定。方法：通过木瓜蛋白酶酶解获得粗多糖，并综合考虑酶解时间、温度、加酶量的影响，获得优化的酶解条件；采用三氯醋酸法除蛋白，Sephacryl S-400凝胶柱层析进行纯化，并测定其相对分子质量和硫酸基含量。结果：酶解最佳条件为加酶量10400U/g，酶解温度55℃，酶解时间6h，多糖得率8.11‰；纯化多糖为组分单一的酸性多糖，分子质量约25kD，硫酸基含量约为9.29%。

仿刺参消化道多糖；分离；纯化

仿刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)，其生存已有5000万年之久[1]，不仅美味可口，而且含有丰富的蛋白质、多糖和脂质，另有少量核酸和多种无机成分。海参多糖因其具有抗肿瘤、抗凝血、提高免疫力等多种活性[2]，一直是海参深加工的重点研究方向之一；但以往研究只局限于海参体壁，而将海参肠道作为废弃物。本研究以仿刺参肠道多糖作为研究对象，主要研究其分离纯化方法，并对其性质进行初步研究，为进一步促进深加工和综合利用这一珍贵的海洋生物资源提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜参肠，产地山东东营。

Sephacryl-S400-HR填料 Ge-healthcare公司；木瓜蛋白酶 Sigma公司；D-葡萄糖 北京拜尔迪生物公司；苯酚、三氯醋酸、醋酸钾、硫酸、葡聚糖等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

5804R 高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Hei-VAP型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；FDU-1200冷冻干燥机 日本东京理化器械株式会社；TU-1810PC紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 消化道多糖的提取

取参肠，洗净后用筛沥水至没有水滴下，投入组织捣碎机捣碎，匀浆，称取30g。加入木瓜蛋白酶，置于恒温水浴锅中酶解。酶解完成后取出酶解液，90℃水浴中加热15min灭酶，7000r/min离心15min[3]，弃去沉淀，取上清液即为粗多糖溶液。酶解过程以不同的酶解温度、酶解时间、加酶量作为单因素试验，以苯酚-硫酸法测其总糖含量[4]，并根据单因素试验结果选取因素水平进行正交试验。通过统计分析获得多糖的最佳提取条件。

1.3.2 消化道粗多糖精制

将粗多糖溶液进行减压蒸发浓缩，取浓缩液加入1/2体积50% TCA溶液，静止过夜[5-6]。再于10000r/min下离心15min，取上清液加入醋酸钾使其浓度达到1.5mol/L，于4℃下静置过夜[7]，离心得纯化的多糖沉淀。将所得多糖加水复溶后，于紫外光谱下扫描。并将离心上清液同样进行扫描，检验多糖是否沉淀完全。

1.3.3 消化道多糖柱层析及相对分子质量测定

取精制后消化道多糖2mL，10000r/min离心10min，取上清液过Sephacryl-S400-HR柱，以三蒸水洗脱，流速0.7mL/min，自动部分收集器收集洗脱液。层析后隔管检测，以管号为横坐标，光密度值为纵坐标绘制洗脱曲线[8]。根据收集液的光密度值合并单一峰。重复数次，将相同峰合并，浓缩干燥后称质量，得到纯化消化道多糖(Apostichopus japonicusalimental tract polysaccharide，SAP)。

取标准葡聚糖，其分子质量分别为1×104、7×104、50×104D，依次上柱洗脱，按其洗脱体积与相对分子质量关系绘制标准曲线[9-11]。并取少量SAP溶于水后过柱，收集洗脱体积，计算相对分子质量。

1.3.4 多糖硫酸基含量测定

采用氯化钡-明胶比浊法[12]测多糖中硫酸基含量。并按标准曲线制作方法测定样品，计算取代度(DS)。

式中：S为样品中硫的含量/%；n为单糖总数；162为多糖相对分子质量；多糖分子中的1个－OH被取代后变为－OSO3Na，相对分子质量增加值为102；32为S的相对分子质量。

2 结果与分析

2.1 苯酚-硫酸法测得的标准曲线

以葡萄糖含量为横坐标，490nm处吸光度为纵坐标，苯酚-硫酸法做标准曲线，得到吸光度和葡萄糖质量浓度的关系：y=0.0081x－0.0008，R2=0.9982。

2.2 仿刺参消化道多糖的提取因素分析

2.2.1 酶解时间对多糖提取的影响

取仿刺参消化道匀浆，每份30g，加木瓜蛋白酶至8000U/g，置于60℃下分别酶解1、2、4、6、8、10h。酶解完成后按1.3.1节操作，苯酚-硫酸法测得率，得图1。

图1 提取时间对吸光度的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time on polysaccharide extraction

如图1所示，酶解时间从1h增加到6h，苯酚-硫酸法测得多糖吸光度显著增大；从6h增大到8h，吸光度略有变化，通过统计学软件分析，变化值不显著。说明多糖在此时已基本提取完全，时间再延长，吸光度也不会明显增加。因此，最佳的酶解提取时间控制在6h左右。

2.2.2 酶解温度对多糖提取的影响

取仿刺参消化道匀浆，每份30g，加木瓜蛋白酶至8000U/g，分别置于30、40、50、60、70、80℃下酶解6h。结果如图2所示。

图2 提取温度对吸光度的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide extraction

从图2可看出，酶解温度从30℃增加到50℃，多糖吸光度显著增大；从50℃增大到70℃，吸光度略有变化，但变化值不明显；而从70℃再上升，多糖吸光度有下降趋势。说明随温度上升，多糖得率逐渐提高，在60℃左右时达到最佳，此后温度再上升，可能相对高温对酶结构产生破坏而影响与底物结合，导致提取率下降[13]。因此，最佳酶解提取温度控制在70℃以下，从经济方面考虑，最佳提取温度为50℃左右。

2.2.3 加酶量对多糖提取的影响

取仿刺参消化道匀浆，每份30g，分别加木瓜蛋白酶至 2000、4000、8000、12000、16000、20000U/g，置于60℃酶解6h。结果如图3所示。

图3 加酶量对吸光度的影响Fig.3 Effect of enzyme amount on polysaccharide extraction

加酶量从2000U/g增加到8000U/g，多糖吸光度显著增大；从8000U/g增大到20000U/g，吸光度变化不明显。说明加酶量在8000U/g以前，底物没有得到充分结合，而在8000U/g时底物蛋白基本结合完全，多糖得以完全释放，再提高加酶量也很难提高得率。因此，最佳的加酶量为8000U/g。

2.2.4 多糖提取条件正交试验

表1 多糖提取条件正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 多糖提取条件正交试验结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

为进一步提高多糖得率，将单因素试验获得的各项最佳条件采用正交试验加以优化。按表1进行正交试验。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for polysaccharide yield with various hydrolysis conditions

通过方差分析可以看出，酶解温度和加酶量对结果有显著性的影响，综合考虑各因素，仿刺参消化道多糖最佳提取条件：加酶量10400U/g，酶解温度55℃，酶解时间6h，得率为8.11‰。

2.3 仿刺参消化道多糖的纯化

粗多糖经除蛋白，醋酸钾沉淀后，进行紫外扫描，结果见图4。

图4 精制多糖紫外扫描图Fig.4 UV-visible scanning spectrum of purified polysaccharide from Apostichopus japonicus alimental tract

从图4可以发现，多糖复溶液在260nm和280nm处均无吸收峰，说明样品中不含核酸和蛋白等杂质；在190～200nm有强烈单一吸收，为多糖类特征吸收峰，表明所提物质为纯化多糖[14]。在上清液扫描图中，在190～200nm没有吸收，表明多糖已沉淀完全。

2.4 仿刺参消化道多糖柱层析及分子质量测定结果

2.4.1 多糖柱层析

图5 精制多糖柱层析曲线Fig.5 Sephacryl S-400 column purification of purified polysaccharide from Apostichopus japonicus alimental tract

精制多糖经过柱层析纯化，分布比较集中，峰形单一对称，说明分子质量大小位于这一范围内的多糖被集中洗脱出，且不含杂质。结果见图5。

2.4.2 多糖相对分子质量测定

通过标准样品获得标准曲线公式为y=－5.9353x+61.26，R2=0.9973。依此计算得SPA分子质量为25kD。

2.5 多糖硫酸基测定

通过标准曲线，计算得－SO42－含量为9.29%，该多糖为一种酸性多糖。

3 讨 论

选用木瓜蛋白酶提取仿刺参消化道多糖。木瓜蛋白酶不仅具有较宽的底物特异性，而且pH值应用范围广，能更好地满足大规模生产的需要；从粗多糖得率来看，达到了8‰，接近仿刺参体壁多糖含量，超过文献[14]报道的得率。粗多糖经除蛋白，柱层析纯化可得到组分单一的多糖，分子质量约25kD。

硫酸酯基在文献报道中属于聚阴离子[15]，其在多糖中的数量和位置对于发挥多糖生物学功能具有重要作用。仿刺参消化道多糖硫酸酯基含量超过9%，但低于文献[16]所报道的体壁多糖硫酸基的含量，其取代基位置也需要做进一步阐明，因此可以考虑对其进行硫酸酯化，利用红外光谱、质谱或核磁共振等手段进行更深层次的研究。

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Papain Hydrolysis for the Extraction of Polysaccharides fromApostichopus japonicusAlimental

CHEN Tao1,2，ZHANG Jian2，WANG Mao-jian2,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China；2. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province, Yantai 264006, China)

The enzymatic hydrolysis ofApostichopus japonicusalimental tract with papain was carried out for polysaccharide extraction, and the obtained polysaccharides were preliminarily characterized. Three hydrolysis parameters including hydrolysis time and temperature as well as enzyme amount were optimized. The relative molecular mass and sulfate group content of the purified product of the crude extract obtained after deproteinization by Sevag method and subsequent Sephacryl S-400 gel filtration chromatography were measured. Enzyme amount of 10400 U/g, hydrolysis temperature of 55 ℃and hydrolysis time of 6 h were found optimal, and the polysaccharide yield was 8.1‰ under these hydrolysis conditions. After Sephacryl S-400 column purification, an acidic polysaccharide with single composition was obtained, and its relative molecular mass might be 25 kD and its sulfate group content was approximately 9.29%.

Apostichopus japonicusalimental tract polysaccharide；extraction；purification

TQ929.2

A

1002-6630(2010)20-0226-04

2010-06-30

国家海洋局海洋公益性行业重大科研专项(200805031)；

国家海洋局海洋经济规划科技推进平台与运作项目(国海科字([2007]219))

陈涛(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：ct01019@163.com

*通信作者：王茂剑(1964—)，男，研究员，本科，研究方向为食品科学与工程。E-mail：wangmaojian@126.com