脑梗死家兔模型内皮损伤程度与梗死范围的关系

杜学军 李利斌 董群芳

内皮损伤是脑梗死的重要病因之一［1］。然而，内皮损伤程度与梗死范围的关系国内报道较少，尤其是在经保护内皮药物的干预下梗死范围是否会有变化，国内外均罕见报道。本研究在制备家兔脑梗死动物模型基础上进行内皮损伤的多指标检测，包括一氧化氮(NO)、内皮素(ET)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)、血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)，P-选择素(GMP-140)，进一步探讨脑梗死发生、发展的病理生理机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物选择、分组与处理 选取成年健康家兔24只(徐州医学院动物实验中心提供)，雌雄各半，平均年龄4个月，平均体质量(2.5±0.2)kg。随机分为假手术组8只，梗死组8只，药物干预组8只。各组动物在年龄、体重、性别上无显著差异。其中药物干预组家兔在术前5 d经胃灌入内皮保护药物通心络0.5 g/(kg·d)(河北以岭药业公司提供)。所有动物均术前肌内注射庆大霉素8万U预防性抗感染。氯氨酮，氯丙嗪各一支混合肌内注射以全麻动物。头部备皮，碘伏消毒。

1.2 大脑中动脉梗死模型制作:采用光化学诱导法(photochemical induced method)［2-3］。所有家兔在麻醉后沿颅骨的中央与眼后角垂直交叉处纵行切开皮肤约2 cm，暴露颅骨，刮离骨膜，在矢状缝偏右(或偏左)0.5 cm与冠状缝后0.5 cm用颅钻钻穿颅骨，造成圆形窗洞。假手术组到此结束，梗死组与药物组动物继续进行。延耳缘静脉缓慢注入四氯四碘莹光素二钠(RB)(浓度35 g/L，总量1 ml/kg)。约3 min后用冷光源(波长540 nm，功率140LX)对准颅骨窗洞，连续照射8 min，缝合皮肤。24 h后，两组动物均出现意识障碍或偏瘫或肌张力下降，均为动物大脑中动脉梗死模型制备成功。

1.3 标本采集、处理与检测方法 24 h后延耳缘静脉抽取静脉血约5～8 ml，注入含10%EDTA30ul和抑肽酶40ul的试管中。4℃条件下以3000 r/min离心15 min，取上清液放入-30℃冰箱中保存待测。NO采用硝酸还原酶法比色测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。ET，VWF:Ag，GMP-140，采用酶联免疫吸付法(ELISA)测定，t-PA与PAI-1活性采用发光底物法，使用德国BE全自动凝血仪。(试剂盒由上海太阳生物技术公司提供)，严格按说明操作。

1.4 相对脑梗死范围测定(TTC法)48 h后将梗死组动物断头取脑，去掉低位脑及脑干，冠状切为0.5 cm的脑片。将脑片浸于2%2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中30 min后取出，再浸于10%甲醛液中固定一周。切取梗死组织，以其质量占大脑质量百分比为梗死范围的相对指标。

1.5 统计学处理 在SPSS 13.0软件上进行。计量资料采用均数±标准差(±s)表示。三组间比效采用方差分析，其中两两比较采用q检验。两组间比效采用t检验。相关分析采用pearson直线相关分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各检测结果见表1。

表1 各组家兔内皮损伤指标检测及统计结果

梗死组动物血中NO、t-PA活性明显低于假手术组(P＜0.01)，而ET、PAI-1、vWF:Ag、GMP-140明显高于假手术组(P＜0.01)。药物组动物的NO、t-PA活性明显高于梗死组(P＜0.01)而 ET、PAI-1、vWF:Ag、GMP-140明显低于梗死组(P ＜0.01)。

2.2 梗死组动物的梗死范围为14.80±6.22%，而药物干预组动物的梗死范围为9.80±4.37%，差异显著(t=7.25 P＜0.01)。

2.3 相关性分析 梗死组动物血中NO和t-PA活性与梗死范围呈负相关(r=-0.823 r=-0.768 P均＜0.01)，而ET、PAI-1活性、vWF:Ag和GMP-140与梗死范围呈正相关(r=0.783，r=0.876，r=0.715，r=0.762，P 均 ＜0.01)。

3 讨论

家兔的脑血管解剖结构及组织类型接近于人类，是较好的研究脑梗死的动物模型［4］。1985年waston率先利用光化学诱导法制成大鼠脑梗死模型。其原理是注射不能通过血脑屏障的光敏药物，经波长560nm的光照后，产生并释放属于自由基的单链氧，使脑血管内皮细胞的不饱和脂肪酸发生酯质过氧化反应，直接损害血管内皮的完整性，使血小板粘付于血管内皮，并发生释放反应，激发凝血过程，导致血管内血栓形成［5］。此方法不仅手术创伤小，制备成功率高，而且能很好地模拟脑血管病理生理变化，有利于内皮功能障碍的研究。

内皮功能受损不仅表现内皮细胞凋亡增加，更重要的是生物活性物质分泌失衡。这些物质的失衡不单纯对血管收缩、舒张起作用，还产生局部炎症，激活局部的神经内分泌反应，使凝血活性增加，纤溶活性下降，并通过一系列细胞信号转导机制激活血小板上受体，使血小板进一步迁移、粘附和产生释放反应［6］。新近研究提示，上述物质失衡还可以抑制脑内神经干细胞的增殖、分化，减少对缺血区的修复作用［7］。

ET与NO是内皮细胞分泌的两种重要的生物活性物质，在正常情况下，二者保持动态平衡。ET是21个氨基酸残基组成的生物多肽，是目前所知血管收缩作用最强最持久的生物肽，在脑血管发病中起重要作用［8］。NO是内皮细胞合成的气体生物活性物质，其前体是L-精氨酸，具有强有力的扩张血管作用，并抑制血小板的粘附与聚集［9，10］。已有研究表明脑梗死患者血ET水平增高，NO水平下降。本研究结论与之相同，但笔者发现:ET水平与梗死范围正相关(r=0.783 P＜0.01)，NO水平与梗死范围负相关(r=-0.823 P＜0.01)，提示ET水平升高，NO水平下降，不仅是脑梗死的始动因素，而且可能与血小板及凝血因子一起给参与了脑梗死的进展过程。与梗死组动物相比较，在内皮保护药物通心络的干预下，药物组动物血中NO偏高且ET偏低，差异显著(P＜0.01)，产生的结果是其梗死范围明显小于梗死组(P＜0.01)。也是这一论点的有力说明。

脑梗死时，损伤的内皮细胞可以激活内外源性凝血系统，使凝血功能显著增强［11］。t-PA与PAI-1是纤溶系统的关键酶，主要来自内皮细胞分泌。t-PA是纤溶系统的主要启动因子，能选择性激活血凝块中的纤溶酶原，生成纤溶酶，水解纤维蛋白，溶解血栓纤维，还能抑制血小板聚集。PAI-1是t-PA的抑制物，可与t-PA形成1:1的复合物，灭活t-PA，对t-PA起调控作用。本实验发现，梗死组动物的t-PA较假手术组显著下降而PAI-1显著升高(P＜0.01)，且t-PA与梗死范围负相关(r=-0.768 P＜0.01)，PAI-1与梗死范围正相关(r=0.876 P＜0.01)，说明:急性期脑梗死24 h内，凝血功能增强的同时纤溶活性下降，血液处高凝状态，可促进血栓的进一步进展。内皮保护药物通心络具有抗凝、提高纤溶活性的作用［12］，因此，与梗死组动物相比，药物组动物t-PA活性增强而PAI-1活性下降，可阻止血栓进展使梗死范围缩小。

VWF是内皮细胞合成的一种多聚体糖蛋白，在调节血小板粘附于受损的内皮过程中起关键作用，内皮细胞受损时释放入血增加，是反映内皮细胞损伤的敏感指标［13，14］。GMP-140是存在血小板a颗粒上的糖蛋白，正常血小板表达很少，血小板活化后随a颗粒的释放而增加。GMP-140在血小板表面高水平表达，是目前所知反映血小板活化和内皮功能损伤最具特异性的分子标志物［15］。Qqizilbash等发现VWF，GMP-140水平增高，是缺血性脑卒中发病的独立危险因素［16］。本研究同时发现，梗死组动物血中VWF:Ag，GMP-140水平显著升高(P＜0.01)，且与梗死范围正相关(r=0.715，r=0.762 P＜0.01)，表明:脑梗死后内皮细胞损伤的同时，血小板活性增强，内皮细胞受损与血小板活性增加密切相关，二者共同促进了脑梗死的进展。从完整意义上讲，内皮保护药物不仅要有保护血管内皮形态、功能的作用，还要有抗血小板的作用。实验表明:通心络在保护血管内皮的同时抑制了 VWF:Ag、GMP-140的表达，从而使梗死范围显著缩小。

脑梗死的进展是指在急性梗死发生后两周内神经症状进行性加重，至今原因不十分清楚［17］。笔者推测内皮功能障碍在脑梗死进展中起一定作用。内皮损伤既有可能是脑梗死发生的原因，也有可能是脑梗死的结果，二者可能在一定范围内形成恶性循环。即:内皮损伤-脑梗死-内皮损伤加重-梗死进展。笔者发现梗死组动物内皮损伤程度与梗死范围有相关性，在内皮保护药物干预下，梗死范围可以缩小，可能是这一过程的表现之一。具体的分子学机制目前尚不清楚，笔者推测:急性梗死后，梗死区周围血管内皮损伤加重，ET水平升高而NO水平下降，动脉血管强烈收缩;局部凝血功能增强而纤溶活性下降，纤维蛋白增多;活化的血小板在纤维蛋白上粘附、聚集;再加上神经修复作用减弱以上共同作用使梗死范围扩大。因此，临床上早期使用扩血管药、降纤药及抗血小板药可改善脑梗死患者的预后。

令人遗憾的是，同时具有上述作用且方便易行、不良反应少的西药太少了。众多实验表明:祖国医药通心络在保护心脑血管内皮方面有积极作用［18］。本研究再次证实:通心络在保护脑血管内皮的同时可显著缩小脑梗死动物的梗死范围。

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