高糖对体外培养的人脐静脉内皮细胞中c-fos的影响研究

刘小鹏 孟晓军 郭杨彬

糖尿病大血管病变是糖尿病常见的严重慢性并发症之一，血管内皮细胞的功能紊乱和损伤是其中一个重要的因素。c-fos是细胞内的一种癌基因，其表达产物Fos和Jun能形成异源二聚体，即有活性的转录因子AP-1，调节基因的表达和蛋白质的合成，从而参与细胞增殖、凋亡等过程。国内外研究表明糖尿病时c-fos原癌基因参与了糖尿病大血管病变的病理生理过程，但c-fos原癌基因在血管内皮细胞表达情况极少见报道。本实验的主要目的是观察在高糖培养条件下，人脐静脉内皮细胞中c-fos mRNA和蛋白的表达变化情况，为糖尿病的临床和基础研究提供有益的探索。

1 材料

新生儿脐带:来自中山大学第五附属医院妇产科健康产妇，无菌操作取下脐带，置PBS溶液中浸泡，4℃冰箱保存，于4 h之内使用;DMEM培养基(低糖型)、胎牛血清(FBS):Gibco公司产品;c-fos抗体:Santa Cruz Biotechnology公司产品，使用浓度为1:50;S-P试剂盒(含二抗羊抗兔):深圳晶美公司产品;AMV cDNA第一链合成试剂盒:BBI公司产品;引物:上海生工生物工程公司合成;PCR扩增试剂盒:上海生工生物工程公司产品;Ⅷ因子相关抗原抗体:ZYMED公司产品，使用浓度为1:100。

2 方法

2.1 细胞培养 参照文献［1］。

2.2 内皮细胞的鉴定 ①倒置相差显微镜观察细胞的形态特点。②Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学检测。

2.3 实验分组及处理 将生长良好的第2代或第3代细胞用于实验。实验分组如下:①对照组(Glu 5.5 mmol/L);②高糖组1(Glu 11 mmol/L);③高糖组2(Glu 22 mmol/L);④高糖组3(Glu 44 mmol/L);⑤甘露醇组(22 mmol/L)。并选取22 mmol/L Glu 分别作用0 h、1/2 h、1 h、2 h 为不同时间点。

2.4 总RNA的提取、cDNA的合成、聚合酶链反应(PCR)按照试剂盒说明书进行，引物序列如下:GAPDH［2］:上游引物:5 ’-GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT-3’，下游引物:5 ’-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3’，目的片段长度:420 bp;c-fos［2］:上游引物:5 ’-AGA ATC CGA AGG GAA AGG AA-3’，下游引物:5 ’-CTT CTC CTT CAG CAG GTT GG-3’，目的片段长度:150 bp。循环参数如下:GAPDH:94℃ 5 min 1 cycle;94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 60 s，30 cycles;72℃ 10 min 1 cycle。c-fos:94℃ 5 min 1 cycle;94℃ 40 s、54℃ 40 s、72℃ 60 s，30 cycles;72℃ 10 min 1 cycle。

2.5 免疫细胞化学 按照试剂盒说明书进行(一抗为Ⅷ因子相关抗原抗体、c-fos，阴性对照用0.01M PBS)。

3 结果

3.1 HUVECs的鉴定 脐静脉内皮细胞融合后在倒置相差显微镜下观察呈单层铺路卵石样免疫细胞化学见Ⅷ因子抗原胞浆颗粒状表达，证实为95%以上的细胞为内皮细胞。

3.2 高糖对c-fos基因表达的影响

3.2.1 总RNA的鉴定 总RNA提取产物在紫外分光光度计下测A260/A280的OD比值在1.8～2.0之间。经1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下可见2条清晰的条带，分别28 s、18 s，且28 s/18 s＞1.5，示 RNA 无明显降解。

3.2.2 c-fos在HUVECs中的转录 PCR扩增后的产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于凝胶图像分析系统摄像，进行灰度分析，结果见下图1、2，c-fos和GAPDH扩增片段分别为150 bp和420 bp，与理论设计相符。

图1 不同处理因素对c-fos mRNA转录的影响

图2 22 mmol/L Glu作用不同时间c-fos mRNA转录

3.2.3 葡萄糖浓度对c-fos mRNA转录的影响 选取5.5 mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、44 mmol/L 浓度组以观察葡萄糖对c-fos基因转录的浓度影响。从图1可以看出，各组GAPDH mRNA水平相差不大，但c-fos mRNA的量从5.5～22 mmol/L随葡萄糖浓度增加而逐渐增高(P＜0.01)，22 mmol/L组达最高峰。其c-fos/GAPDH mRNA比值见表1。

表1 葡萄糖浓度对c-fos mRNA转录的影响(n=3)

3.2.4 葡萄糖作用时间对c-fos mRNA转录的影响 根据量效结果，选取22 mmol/L为作用浓度，观察葡萄糖对c-fos基因表达的时间影响。从图2可以看出，c-fos mRNA水平逐步增高，2 h组中表达降低(P＜0.01)。c-fos的灰度比值见表2。

表2 葡萄糖作用时间对c-fos mRNA转录的影响(n=3)

3.2.5 高糖对c-fos蛋白表达的影响 HUVECs经过22 mmol/L高糖处理2 h免疫细胞化学检测为阳性(见下图3)，而未经高糖处理为阴性(见下图4)。

图3 22 mmol/L Glu作用2 h c-fos蛋白表达(S-P法40×)

图4 正常Glu c-fos蛋白表达(S-P法40×)

3.2.6 甘露醇对c-fos转录的影响 从图1可以看出，甘露醇组与相应正常葡萄糖组比较，c-fos mRNA水平无明显升高(P＞0.05)。相关灰度比值数据从略。

4 讨论

c-fos属于即刻早基因，正常情况下在大多数细胞都有极低水平的表达，参与细胞的正常生长、增殖、分化、调节细胞内信息传递等生理过程。在受到多种伤害性时，能迅速表达，参与细胞的凋亡、修复等过程。但一般来说，其表达快速、短暂;mRNA半衰期短，不稳定;并且通过亮氨酸拉链结构与Jun蛋白形成异源性二聚体复合物，即具有活性的转录因子复合物AP-1，AP-1通过顺式作用激活相关的基因，从而调节基因的表达与蛋白质的合成［3］。

本研究发现高糖(22 mmol/L)作用下，HUVECs中c-fos的mRNA水平在1 h左右达到高峰，随后下降。随葡萄糖浓度增高c-fos mRNA表达量也增加，葡萄糖浓度至22 mmol/L达最高峰，44 mmol/L时下降，其原因可能与葡萄糖浓度过高毒性作用增加抑制细胞活性等有关。c-fos蛋白表达也随时间延长而逐渐增高，至2 h达最高峰，随后下降，与其他研究基本一致［4］。甘露醇组c-fos mRNA转录和蛋白表达无明显增高。

高糖引起HUVECs c-fos转录和蛋白合成增加的原因未明，目前认为可能与PKC通路激活有关，笔者前期的工作也发现了类似结果。AP-1是PKC的经典核内靶分子。高糖激活PKC通路的机制如下:①从头合成(de novo)途径:高糖经酵解产生中间产物，逐步酰化合成DAG，此为高糖激活PKC的主要途径;②磷脂酶D水解磷脂酰胆碱生成DAG途径;③山梨醇通路激活、蛋白质非酶糖化、氧化应激均可使DAG生成增加而激活 PKC［5］。

笔者发现高糖时HUVECs中PKC通路激活一方面可以引起VEGF的转录和蛋白质合成增加［6］，因此可能导致血管内皮细胞增生，新生血管形成;另一方面引起c-fos转录和蛋白合成增加，从而导致内皮细胞的凋亡［7］。具体哪方面因素何时占主导地位，可能是一个值得研究的课题。在此，不妨可以大胆假设一下:在糖尿病的早期，以第一条途径为主，此时表现出来的是内皮细胞增生，血管内皮层较为完整;至中晚期，则第二条途径占主导地位，因此出现内皮细胞的凋亡，血管内皮层的破坏，进而出现糖尿病大血管的典型病变。

［1］王立岩，冬晓红，宫桂兰，等.人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察.白求恩医科大学学报，2000，26(1):26-28.

［2］Shinichi Sakurai，Shahabuddin Alam，Glorivee Pagan-Mercado，et al.Retinal Capillary Pericyte Proliferation and c-fos mRNA Induction by Prostaglandin D2 through the cAMP Response Element.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43:2774-2781.

［3］Liang F，Seyrantepe V，Landry K，et al.Monocyte differentiation upregulates the expression of the lysosomal sialidase，neul，and triggers its targeting to the plasma membrane via major histocompati-bility complex classⅡ-positive compartment.J Biol Chem，2006，281(37):27526-27530.

［4］宋冰，魏执真，吕仁和.中药糖心宁口服液对血管平滑肌细胞原癌基因c-myc和 c-fos表达的影响.中医杂志，2004，45(4):292-294.

［5］Scivittaro V，Ganz MB，Weiss MF.AGEs induce oxidative stress and activate protein kinase C-βⅡ in neonatal mesangial cells.Am J Physiol，2000，278:F676-683.

［6］刘小鹏，罗春英，曹仁贤，等.高糖作用下HUVECs中VEGF基因表达与PKC通路的关系研究.中国动脉硬化杂志，2006，14(1):17-20.

［7］罗春英，刘小鹏，文格波，等.p38丝裂素活化蛋白激酶在高糖损伤人脐静脉内皮细胞中的作用.中国动脉硬化杂志，2006，14(10):853-856.