响应面法优化海参卵酶解工艺

赵鸿霞 周大勇 秦 磊 朱蓓薇 王晓慧

（大连工业大学食品工程学院，辽宁 大连 116034）

响应面法优化海参卵酶解工艺

赵鸿霞 周大勇 秦 磊 朱蓓薇 王晓慧

（大连工业大学食品工程学院，辽宁 大连 116034）

以水解度和肽得率为评价指标，从4种酶中选择出木瓜蛋白酶为水解海参卵最佳用酶。利用二次回归旋转正交组合设计，建立关于木瓜蛋白酶水解海参卵过程中温度、pH值、底物浓度对水解度影响的三元二次方程。通过对方程的拟合分析得到木瓜蛋白酶的最佳工艺条件并修正为：温度52℃、pH值5.5、底物浓度8.4%、加酶量2 500U/g、反应时间4h。在此条件下，水解度为20.51%。

海参卵；酶解；响应面

生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的肽类的总称［1］。研究［2］表明，活性肽具有调节免疫力、调节激素分泌、抗肿瘤、降血压、抗氧化、抗疲劳、改善元素吸收及运输和促进生长等作用，具有重要的应用价值。由于生物中天然存在的活性肽含量较低，不适合大规模开发利用，近年来研究者多以生物蛋白为原料降解制备活性肽［3］。目前，大量的生物活性肽被发现并已广泛应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域，取得了良好的社会效益和经济效益［4］。

海参卵 （刺参，stichopus japonicus），俗称海参花，是海参加工过程中产生的废弃物之一。海参卵不仅与海参体壁含有同样丰富的蛋白质和活性物质，而且许多珍贵营养成分含量更高，如多糖、钒、核酸、性腺色素、精氨酸等。海参肠卵中钒的含量是海参体壁的3～4倍。钒能维持机体正常的糖代谢作用，有效地防治糖尿病，还能刺激机体的造血功能，促进骨骼的造血能力［5］。近年来，中国海参产业发展迅速，2008年，中国海参总产量约为9万t［6］。本试验以海参卵为原料，利用生物酶法制备生物活性肽，并通过响应面法对酶解工艺进行优化，可为海参卵的加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

海参卵：大连獐子岛渔业集团有限公司；

碱性蛋白酶（Alc）：49 600U/g，四川华威高科技生物有限公司；

中性蛋白酶（Neu）：59 000U/g，南宁庞博生物工程有限公司；

胰蛋白酶（Try）：52 900U/g，夏门星隆达化学试剂有限公司；

木瓜蛋白酶（Pap）：44 700U/g，上海生物工程有限公司；

其他试剂与药品：均为市售分析纯。

1.2 主要仪器

数显恒温水浴锅：HH－4，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

精密电子天平：JJ200Y型，美国双杰兄弟（集团）有限公司；

集中式恒温加热磁力搅拌器：DF－101S，巩义市英峪予华仪器厂；

超滤搅拌器：8050，Millipore（密理博）公司；

真空冷冻干燥机：2KBTES－55，美国VirTis公司；

组织捣碎匀浆机：JJ－2型，金坛市富华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理 海参卵经清洗、冷冻干燥、粉碎、过100目筛后，贮于－20℃备用。

1.3.2 原料的酶解 分别采用木瓜蛋白酶（Pap）、中性蛋白酶（Neu）、胰蛋白酶（Try）和碱性蛋白酶（Alc）对海参卵酶解，根据文献［7－8］并结合酶制剂说明书制定各种酶的酶解条件见表1，操作过程如下：

精密称取原料→加水→调pH值→加酶→保温水解→灭酶（100℃，10min）→定容→离心（4 000r/min，10min）→上清液（测水解度）超滤→冷冻干燥

表1 4种酶的试验条件Table 1 Hydrolytic conditions for the four enzymes used

1.3.3 水解度的测定 水解度的测定采用甲醛滴定法［9－11］。水解度（DH）按式（1）计算：

1.3.4 其它测定方法

（1）总氮含量：采用微量凯氏定氮法［12］；

（2）酶活力测定：采用Folin－酚法［13］。

1.3.5 单因素试验 以木瓜蛋白酶为水解酶，以水解度为评价指标，研究酶加量、酶解时间、pH值、酶解温度和底物浓度等对酶解效果的影响。基本条件为：酶加量2 500U/g；底物浓度8%；pH 6.5；反应温度55℃；水解时间3h，改变其中一个条件，固定其它条件以分别考察不同的影响因素，各因素水平梯度分别为：反应温度45，50，55，60，65 ℃；pH 4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5；酶加量1 500，2 000，2 500，3 000，3 500，4 000U/g；底物浓度4%，6%，8%，10%，12%；去离子水体系水解时间0.5，1.5，2.0，3.0，4.5，5.0h；缓冲液体系水解时间1.5，2.5，3.5，4.5，5.0h。水解完成后在沸水浴中保持10min灭酶，采用甲醛滴定法测定水解度。1.3.6 响应面试验设计 利用Design－Expert软件根据Box中心组合原理［14］，以海参卵水解度DH（%）作为响应值，设计试验确定一个最佳的酶解条件。试验数据用Design－Expert 7.0软件进行多项式回归分析，通过回归拟合后期望得到主要试验因子对响应值影响的二阶经验模型：

式中：

Y——预测响应值即水解度DH，%；

β0，βi，βii，βij—— 分别是偏移项、线性偏移、二阶偏移系数和交互效应系数；

Xi—— 各因素水平值。

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶酶解效果的比较

由表2可知，水解产物的水解度高，肽得率也相应较高。但这种规律并不严格，肽得率的除了受水解度影响，还与酶的特异性有关［15］。考虑到工业化生产的效益，选择肽得率较高的木瓜蛋白酶为水解用酶。

表2 4种酶酶解产物的水解度和肽得率Table 2 DH and yield of peptide of the hydrolysates derived from the four enzymes

2.2 响应面法对酶解工艺的优化

根据单因素试验结果，并依据提高效率、节约成本的原则，将加酶量定为2 500U/g，酶解时间定为4.0h。利用Design－Expert软件根据Box中心组合原理设计了因素水平表（见表3）共16个试验点的的响应面分析试验，其中1～12为析因试验，13～16为中心点试验用来估算误差，以此确定利用木瓜蛋白酶酶解海参卵功能肽的最佳工艺条件。试验设计方案与结果见表4。

表3 响应面试验因素与水平表Table 3 Factors and levels in response surface design

2.2.1 响应面试验结果分析 根据表4试验结果，采用Design－Expert 7.0软件进行方差分析，结果见表5。回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性由F检验来判定，概率（P＞F）的值越小，则相应变量的显著程度越高（P＞F小于0.05是显著的）。由响应面结果的方差分析可知，模型P＞F值（＜0.000 1）意味着此二次模型是极显著的，即模型建立成功；且温度项A、底物浓度项C、交互项BC、平方项A2、B2、C2对蛋白质水解度的影响显著；pH值项B、交互项AB、AC对蛋白质水解度的影响不显著。

表4 Box－Behnken试验设计与结果Table 4 Experimental design and results of Box－Behnken

表5 响应面二次模型的方差分析ńTable 5 Analysis of variance of quadratic model in RSM

用Design－Expert 7.0软件分析模型的可信度，见表6，得出回归方程的各因变量和全体自变量之间的复相关系数R2＝107.35/108.96＝0.985 2，说明响应值（水解度）的变化有98.52% 来源于所选变量，即提取温度、pH和底物浓度，因此回归方程能较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件；一般来说，信噪比大于4时模型可信，试验测得信噪比为18.093，远大于4，进一步说明模型可靠。

表6 模型的可信度分析Table 6 The credibility analysis of the model

根据Design－Expert 7.0软件得出回归模型各因素相互作用的效应图，见图1～3。

图1 温度与pH值关于水解度的等高线和响应面图Figure 1 RSM contour plots showing effect of Temp and pH on DH

图3 pH值与底物浓度关于水解度的等高线和响应面图Figure 3 RSM contour plots showing effect of pH and substrate concentration on DH

图1显示pH值与反应温度交互作用对水解度的影响，固定了底物浓度为8%，形成了pH值与反应温度的等高线及响应面图，从图中可以看出，因素A、B对Y是非线性的，因为表面图发生弯曲，可以做进一步优化分析。同理从图2、图3也可以看到表面图发生弯曲，得出A、C，B、C对Y也存在二次项，可以做进一步优化分析。

将试验数据利用Design－Expert7.0软件各因素进行回归拟合分析得到的海参卵水解度（用Y表示）的回归方程：

Y＝－52.80＋1.42A＋9.50B＋2.39C－3.89×10－3AB＋2.67×10－3AC＋0.65BC－0.014A2－1.34B2－0.36C22.2.2 响应因子的水平优化 各因素水平的优化运用Design Expert 7.0软件，对回归模型进行规范形分析，寻求最大值的稳定点及对应的因素水平。根据三元二次回归方程求最佳稳定点（极值点）的值，分别对回归方程各因素求一阶偏导且令方程等于零，整理得：

解方程组得到模型的极值点为：A＝52.06，B＝5.50，C＝8.42。

把极值点代入回归方程，解得方程最大值为20.27%。

即最佳理论工艺条件为：温度52.06℃、pH值5.5、底物浓度8.41%、加酶量2 500U/g、反应时间4h。在此条件下，理论水解度为20.27%。考虑到实际操作的便利，将酶解的最佳提取工艺条件修正为：温度52℃、pH值5.5、底物浓度8.4%、加酶量2 500U/g、反应时间4h。在此修正条件下，实际测得海参卵的水解度为20.51%，与此条件下的预测值相差不到0.5%，说明试验结果与模型符合良好，建立的回归方程能真实地反映pH值、温度、底物浓度对海参卵水解度的影响，通过此模型优化能够有效的提高海参卵的水解度。

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Optimization of the enzymatic hydrolysis of sea cucumber（stichopus japonicus）ovum with response surface method

ZHAOHong－xia ZHOU Da－yong QIN Lei ZHU Bei－weiWANG Xiao－hui

（College of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China）

In the present study，papain was selected as the optimum enzyme for hydrolysis of sea cucumber（stichopus japonicus）ovum from the four proteases as which lead to the highest degree of hydrolysis（DH）and yield of peptides.A ternary quadratic equation was established between temperature，pH，substrate concentration and DH based on quadratic rotation－orthogonal combination design.Through simulation analysis of the equation，the optimum conditions were obtained and listed below：the hydrolytic temperature is 52℃；the reactive pH is 5.5；the substrate concentration is 8.4%；the enzyme/substrate ratio is 2 500U/g；the hydrolytic time is 4h.Under such a condition，the hydrolysis degree is 20.51%.

sea cucumber ovum；enzymolysis；response surface method（RSM）

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.033

国家“十一五”科技支撑计划（编号：2008BAD94B07）；辽宁省重点实验室项目（编号：2008403003）

赵鸿霞（1977－），女，大连工业大学在读硕士研究生。E－mail：398010423＠qq.com

周大勇

2010－06－01