酶法提取浒苔多糖工艺优化的研究

肖宝石 吕海涛

（青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109）

酶法提取浒苔多糖工艺优化的研究

肖宝石 吕海涛

（青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109）

以浒苔为原料，研究浒苔多糖的热水浸提－木瓜蛋白酶联合提取工艺。在单因素试验的基础上采用正交试验设计，对浒苔多糖的提取条件进行优化。结果表明，提取温度80℃，提取时间4h，料液比1∶50g/mL，提取2次的条件下，热水浸提效果最佳。木瓜蛋白酶用量8%，酶解温度60℃，酶解时间2h，料液pH 5.5的条件下，酶解效果最佳。浒苔多糖得率为27.75%，粗多糖纯度为50.03%。

浒苔多糖；木瓜蛋白酶；提取；正交试验设计

浒苔（enteromorpha proliferaha）为绿藻门石莼目石莼科植物，广泛分布于海洋沿岸低潮区的沙砾、岩石、滩涂和石沼中，也是中国近海常见的一种大型经济藻类。浒苔自古以来即为食用和药用藻类，含有多种活性功能成分，药用价值高，开发潜力大［1］。浒苔多糖是其主要活性成分，存在于藻体细胞中，具有降血脂、抗衰老、增强免疫反应、对皮肤癌抑制作用等诸多的生理功能［2－4］。

目前，浒苔多糖的提取常采用水提醇沉法［5－7］，但浒苔中部分多糖是与蛋白结合的，醇沉时以糖蛋白的形式沉降，降低了产品的纯度。本试验在热水浸提的基础上采用酶法提取浒苔多糖，在多糖浸提过程中加入蛋白酶，可对细胞结构产生破坏作用，将与多糖结合的蛋白质酶解，使存在于细胞内部的多糖更快、更有效地释放出来，使多糖粗产品具有更高的纯度和蛋白质脱除率。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

浒苔：采于青岛近海。

无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖：分析纯，天津市津东天正精细化学试剂厂；

木瓜蛋白酶：65万u/g，厦门星隆达化学试剂有限公司；

牛血清蛋白：美国Sigma公司；

考马斯亮蓝G－250：上海试剂三厂；

高速组织粉碎机：FW80－1，天津市泰斯特仪器有限公司；

医用低速离心机：90－2，江苏省金坛市恒丰仪器厂；

pH计：Delta320，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

电子天平：AR2140，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

紫外可见分光光度计：SP－754，上海光谱仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE－52AA，上海亚荣生化仪器厂；

恒温水浴锅：HH－S，江苏省金坛市金城国际实验仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 提取工艺流程

脱脂后浒苔干品→热水浸提→快速冷却→调pH→加酶酶解→酶灭活→过滤，离心→上清液→真空浓缩→乙醇醇沉→沉淀物过滤→滤饼干燥→浒苔粗多糖

1.2.2 材料预处理 新鲜浒苔用自来水洗净、干燥至恒重，粉碎，过40目筛，用乙醇在索氏提取器脱脂3次，烘干，备用。

1.2.3 浒苔多糖含量的测定 采用苯酚－硫酸法［8］。称取干燥至恒重的葡萄糖50.0mg，于50mL容量瓶中加水溶解、定容。量取2.5mL溶液于50mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制成储备液。分别吸取上述溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，加水稀释至1.0mL，分别加入5%苯酚1mL，混匀，再迅速滴加5mL浓硫酸，振荡混匀，放置30min，以蒸馏水作为空白，在490nm波长处测定吸光度（A），回归方程为：c（mg/mL）＝0.004A＋0.013，相关性系数为0.996 2。

取粗多糖样品100mg，溶解，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，摇匀后吸取0.2mL样液，按照上述方法测定，根据回归方程计算多糖浓度，再按式（1）计算多糖提取率。

1.2.4 浒苔多糖蛋白含量的测定 采用考马斯亮蓝法［9］。显色剂：100mg考马斯亮蓝G－250溶于50mL乙醇，加入100mL 85%H3PO4，蒸馏水定容至1L。准确称取牛血清白蛋白250mg溶于蒸馏水，定容至50mL，蛋白浓度为1mg/mL。分别吸出2，4，6，8，10mL定容至100mL，配制成浓度为20，40，60，80，100μg/mL的蛋白质标准溶液。分别吸取1mL牛血清白蛋白标准溶液，加入5mL显色剂，以蒸馏水作空白溶液，振荡，25℃反应10min后在595nm处测吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，蛋白浓度（c）为横坐标作图，做标准曲线，得到回归方程：c（mg/mL）＝0.005 2A＋0.007 4，相关性系数为0.998 5。

将样品稀释至适当浓度，吸取1mL样液，按1.2.4操作，在595nm处测定吸光度，按回归方程计算蛋白含量。

1.2.5 浒苔多糖热水浸提工艺的优化 以时间、温度、料液比及提取次数作为考察因素，以浒苔多糖提取率为评价指标进行单因素试验。并在单因素预试验的基础上，设计L9（34）正交试验，以浒苔多糖提取率为评价指标，优化提取工艺。

1.2.6 浒苔多糖酶法提取工艺的优化 在浒苔多糖热水浸提最佳提取工艺的基础上，以木瓜蛋白酶用量、浸提液温度、pH及酶解时间作为考察因素，以浒苔多糖提取率为评价指标进行单因素试验。并在单因素预试验的基础上，设计L9（34）正交试验，优化最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 浒苔多糖热水浸提工艺的优化

通过热水提取浒苔多糖单因素试验可得，浒苔多糖提取率随着温度的上升而增加，当温度达到80℃时上升趋势变缓。提取时间在1～4h之间时，多糖提取率随着时间的延长而增加，在4h时达到最大值；此后，随着时间的延长，多糖提取率有下降的趋势，可能是由于高温下长时间提取会逐渐造成多糖的降解。多糖提取率随着料液比的增加而升高，料液比为1∶40以后，多糖提取率随着料液比的增加变化不明显。多糖提取率随着提取次数的增加逐渐升高，超过3次时，提取率逐渐趋于平缓。

根据单因素实验确定正交试验的因素和水平，作L9（34）正交试验（表1），试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 浒苔多糖热水提取正交试验的因素及水平Table 1 Orthogonal experiment factor and level by hot water method

表2 浒苔多糖提取的正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments of extraction of polysaccharide in Enteromorpha

表3 方差分析结果Table 3 The square variance analysis result

由表2可知，4个因素对多糖提取的影响程度为：时间＞提取次数＞料液比＞温度，其最佳工艺组合为B3A3D3C3，即温度为100℃，固液比为1∶60（m∶V），时间为4h，提取次数为3次。由表3可知，各试验因素对多糖提取效率的统计结果均无显著影响。考虑到实际工业生产的要求，为缩短生产周期，减小生产成本，选择最佳工艺条件为B3A2D2C1，即温度为80℃，固液比为1∶50（m∶V），时间为4h，提取次数为2次。

为了验证该试验结果，按此工艺条件对浒苔进行提取，重复3次，多糖平均得率为22.53%，粗多糖纯度为46.29%，蛋白含量为0.86%。多糖得率略高于正交试验组所测得的最高得率，故认为最佳工艺参数可行。

2.2 浒苔多糖酶法提取工艺的优化

通过酶法提取浒苔多糖单因素试验可得，随着木瓜蛋白酶用量的增大，多糖提取率逐渐增大。酶用量在8%时，多糖收率最高。酶用量太低，酶解不完全；用量过高，底物被酶分子所饱和，一部分酶分子没有机会与底物结合，水解的速度降低，多糖得率不再增加，并且过量蛋白酶的加入也会给后续蛋白质的去除增加困难。最佳酶解pH值为5左右，pH值会影响酶分子侧链上极性基团的解离，影响酶空间构象，引起酶活性的变化。最适提取温度是50℃左右。温度过低，生物酶活性较低；温度升高可加速反应速度，但超过酶最适反应温度会使酶变性失活。随时间延长酶解程度加深，多糖得率增高；酶解2h时，酶解反应基本完全，再延长时间多糖收率增加不明显。

在单因素试验结果的基础上，以多糖提取率为考察指标，设计正交试验（表4），正交试验结果见表5。

表4 浒苔多糖酶法提取的正交试验因素水平表Table 4 Orthogonal experiment factor and level by papain method

表5 酶法提取浒苔多糖的正交试验结果Table 5 Results of orthogonal experiments of extraction of polysaccharide in Enteromorpha

由表5可知，4个因素对多糖提取的影响程度为：酶解温度＞pH＞酶用量＞提取时间，其最佳工艺组合为B3A3D3C3，即提取温度60℃，提取时间4h，酶用量8%，pH 5.5。由表6可知，各试验因素对多糖提取效率的统计结果均无显著影响。考虑到实际生产，最佳工艺条件为A3D3C3B2，即提取温度60℃，提取时间2h，酶用量8%，pH 5.5。

为了验证该试验结果，按最佳工艺条件进行提取，重复3次，多糖的平均得率是27.75%，粗多糖纯度为50.03%，蛋白含量为0.78%。多糖得率高于正交试验中的任何一组，说明该工艺稳定可行。与单纯的浒苔多糖热水浸提工艺比较，多糖的得率和粗多糖的纯度均有提高，蛋白含量降低。

表6 正交实验方差分析表Table 6 The square variance analysis result

3 结论

采用木瓜蛋白酶水解浒苔多糖－蛋白复合物中的蛋白质，使存在于细胞内部的多糖更快、更有效地释放出来，不但可以提高多糖的提取效率，而且降低了粗多糖中的蛋白含量，提高了多糖的纯度。此外，木瓜蛋白酶较大改善了浒苔样液的性状，降低其粘稠度，减少浒苔粗多糖的色素含量，为多糖的后续纯化提供便利条件。

1 林文庭.浅谈浒苔的开发与利用［J］.中国食物与营养，2007（9）：23～25.

2 周慧萍，蒋巡天，陈琼华，等.浒苔多糖的降血脂及其对SOD活力和LPO含量的影响［J］.生物化学杂志，1995（11）：161～165.

3 Kiyoka Hiqashi－Oka，Shuzo Otani，Yasuji Okai.Potent suppressive effect of a Japanese edible seaweed，enteromorpha prolifera（sujiao－nori）on initiation and promotion phases of chemically induced mouse skin tumorigenesis［J］.Cancer Letters，1999（140）：21～25.

4 徐大伦，黄晓春，杨文鸽，等.浒苔多糖的分离纯化及其对非特异性免疫功能的体外实验研究［J］.中国食品学报，2006，6（5）：17～21.

5 吕玲玲.浒苔水溶性多糖提取工艺的优化研究［J］.安徽农业科学，2009，37（24）：11 717，11 756.

6 张智芳，林文庭，陈灿坤.浒苔水溶性多糖提取工艺研究［J］.中国食物与营养，2009（3）：39～41.

7 吴明江，焦丽丽，孙永旭，等.浒苔多糖EPIII的分离与鉴定［J］.东北师大学报（自然科学版），2007，39（1）：97～100.

8 苏拨贤.生物化学制备技术［M］.北京：科学出版社，1986：32～33.

9 张龙翔，张庭芳，孔令媛.生物化学实验方法与技术［M］.第二版.北京：高等教育出版社，1997：136～137.

Optimization on enzymatic extraction of polysaccharides from enteromorpha

XIAO Bao－shiLVHai－tao

（College of Chemistry＆ Pharmacy，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong266109，China）

The extraction technology of enteromorpha polysaccharide by hot water－papain method was investigated through orthogonal test on the basis of single factor experiment.The result showed the optimal extracting conditions by hot water were as follows：Extraction temperature 80 ℃，extraction time 4h，the ratio of solid－liquid 1∶50，and extracting the sample 2times.The optimal extracting conditions by papain were as follows：the amount of papain 8%，enzymolysis temperature 60℃，enzymolysis time 2h，and the pH of extracting media 5.5.Under the optimal extracting conditions，the extraction rate of polysaccharides was 27.75%.The purity of crude polysaccharides was 50.03%.

enteromorpha polysaccharides；papain；extraction；orthogonal test

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.036

青岛农业大学自然科学类重点项目（编号：610608）

肖宝石（1985－），男，青岛农业大学在读硕士研究生。E－mail：xiaobaoshi2010＠126.com

吕海涛

2010－05－10