SSRP1基因的克隆及其参与DNA损伤应答的初步研究

江洁，洪泽辉

(1．南京市市级机关医院内科，江苏南京 210018;2．东南大学医学院遗传与发育生物学系，江苏南京 210009)

Structure-specific recognition protein 1(SSRP1)是一个组蛋白的伴侣分子，在细胞内和Spt16相互作用形成一个异源二聚体FAcilitates Chromatin Transcription(FACT)［1-2］。最近研究发现，SSRP1 参与 Cisplatin诱导的DNA损伤应答［3］，但具体机制还不清楚。在本研究中，我们应用激光共聚焦显微镜技术观察到SSRP1快速聚集到激光诱导的DNA损伤部位，显示了SSRP1在DNA损伤应答中的动态变化情况，我们的结果证实SSRP1参与DNA损伤应答。

1 材料和方法

1． 1 材料

HeLa细胞，宿主菌E．Coli DH5α，绿色荧光载体EGFP-C1(本实验室保管)。

1． 2 方法

1．2．1 SSRP1 cDNA扩增 按RNA提取试剂盒(南京生兴生物技术有限公司)操作程序从HeLa细胞中提取总RNA，随后以1 μg RNA为模板，按逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)操作程序将mRNA逆转录为总cDNA。根据NCBI上SSRP1的基因序列，分别设计上下游引物，并在5'端加上相应酶切位点和保护性碱基。SSRP1上游引物:5'-AAACTCGAGATGGC AGAGACACTGGAGTTCAACGACGTC-3';下游引物:5'-TTTGCGGCCGCTCTCATCGGATCCTGACGCTGAGTC CTC-3'，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR扩增体系:cDNA模板3 μl，上下游引物分别为2 μl(终浓度0．8 pmol·μl－1)，dNTP 2 μl，5 × PCR buffer 5 μl，HS primerstar polymerase 0．25 μl(大连宝生物工程有限公司)，补加灭菌蒸馏水至25 μl。扩增条件为:预变性98℃ 30 s;变性98℃ 10 s，退火65℃15 s，延伸72℃ 2 min，35循环;最后延伸72℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1．2．2 EGFP-C1-SSRP1表达载体的构建 将在琼脂糖凝胶上的PCR产物进行割胶纯化，纯化后PCR产物用XhoⅠ和NotⅠ(大连宝生物工程有限公司)进行双酶切，酶切后后的PCR产物再进一步琼脂糖凝胶电泳、割胶和纯化。纯化后产物与已作相同酶切的EGFP-C1载体连接，随后涂平板、挑克隆、扩增，最后提质粒，用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定。鉴定后的质粒进行全基因测序，测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。……