利用超分子体系模拟生物体G蛋白耦联受体型信号转导过程

刘宝全，王剑锋，石太德，范圣第

（大连民族学院生物化学工程国家民委－教育部重点实验室，辽宁大连 116605）

利用超分子体系模拟生物体G蛋白耦联受体型信号转导过程

刘宝全，王剑锋，石太德，范圣第

（大连民族学院生物化学工程国家民委－教育部重点实验室，辽宁大连 116605）

以生物体G蛋白耦联受体型信号转导过程为模拟原型，利用自组装方法构建了具有分子间信号转导能力的超分子体系。带正电荷的肽脂质分子与人工受体共同形成脂质体，乳酸脱氢酶（LDH）（效应器）通过静电作用吸附到脂质体上，乳酸脱氢酶的竞争性抑制剂（Cu2+）抑制LDH活性（相对酶活性为11.6%），进而共同组成了一个酶活性处于关闭状态的超分子系统。向超分子体系中加入信号分子——磷酸吡哆醛（PLP）后，PLP通过静电作用吸附到带正电荷的脂质体表面，并与人工受体形成希夫碱;希夫碱与LDH竞争铜离子，解除铜离子对LDH活性的抑制，恢复LDH的催化活性，使相对酶活性达到83.0%。实验结果表明，超分子体系完成了从信号分子到效应器（酶）活性变化的信号转导过程，可以利用超分子体系构建调控酶催化活性的超分子器件。

超分子体系;信号转导;乳酸脱氢酶;纳米器件

1 G蛋白耦联受体型信号转导的仿生设计

G蛋白耦联受体型信号转导过程涉及到细胞的生长与分化、细胞凋亡等生理过程，是信号转导研究的热门领域;信号转导过程主要分为4个环节:①信号分子激活膜上受体，②激活的受体顺次激活G蛋白，③激活的G蛋白顺次激活效应器，④效应器形成（表现）活性;涉及到的主要功能元件有5种:细胞膜、信号分子、受体、第二信使、效应器（酶）［1］。

分别设计与合成相应的化学元件用于替代天然体系（G蛋白耦联受体型信号转导系统）的功能组分，利用超分子化学理论与技术，构建G蛋白耦联受体型信号转导的仿生系统［2－5］。人工体系与天然体系中功能元件的对应关系总结于表1。

表1 人工体系与天然体系的对应关系

超分子体系的设计如图1。整个体系由5个部分构成，即人工脂质N+C5Gly2C16（肽脂质）形成双分子膜脂质体作为反应场，吡哆醛磷酸（pyridoxal 5-phosphate，PLP）为信号分子，人工合成的含活性氨基分子为受体，二价铜离子为信使，乳酸脱氢酶（lactate hydrogenase，LDH）为效应器（酶）。

图1 模拟G蛋白耦联受体信号转导的人工超分子体系示意图

2 超分子体系组成元件的构建

2.1 试剂

十六烷基溴、十六烷基胺、Boc－Ala、Boc－Gly （Sigma公司）;二环己基碳二亚胺（DCC）、6－溴己酰氯（东京化成工业株式会社）;4－羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）（北京夏斯生物有限公司）;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（NADH）（上海蓝季科技发展有限公司，进口分装）;丙酮酸钠（Fluka试剂）、L－乳酸脱氢酶（LDH，提取自猪心肌） （Roche Diagnostics GmbH Mannheim，德国）。其他为国产分析纯试剂。

2.2 仪器

核磁共振仪Varian Mercury plus 400（美国）， Lambda 25紫外－可见分光光度计（PerkinElmer，美国），Sonifier 250D超声仪（BRANSON，美国），JEM－2000EX透射式电子显微镜（JEOL，日本）。

2.3 肽脂质的合成

肽脂质的合成路线［6－8］如图2。最终合成的肽脂质——溴化N，N－二－十六烷基－Nα－6－三甲胺基己酰基－L－丙氨酰胺（N+C5Ala2C16），其核磁检测结果为:1H－NMR（400 MHz，CDCl3，TMS）∶δ0.88［6H，t，J=7.1 Hz，（CH2）13CH3］，1.25－1.35［54H，m，N（CH2）2（CH2）13CH3，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2］，1.36［6H，d，J=6.9 Hz，CHCH3］，1.45－1.53［6H，m，NCH2CH2（CH2）13CH3，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2CH2CO］，1.65－ 1.70［2H，m，（CH3）2NCH2CH2CH2CH2CH2CO］，3.58［2H，t，J=7.7 Hz，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2CH2CO］，3.48［9H，s，（CH3）3N+CH2CH2］，2.24［2H，t，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2CH2CO］，3.11［1H，m，NCH2（CH2）14］，3.25［1H，m，NCH2（CH2）14］，4.78［1H，m，J=7.1 Hz，CHCH3］，7.02［1H，d，J=7.4 Hz，CONH］。

图2 肽脂质合成的技术路线

2.4 人工受体的合成

人工受体的合成方法与肽脂质合成［6－8］相似，只是在第3步合成时，用带保护基的不同氨基酸与双十六烷基胺（产物2）反应，再通过水解反应去除保护基后，即得系列人工受体，其活性基团为氨基。合成的双十六烷基丙氨酰胺，进行核磁检测，结果为:1H－NMR（400 MHz，CDCl3，TMS）: δ0.88［6H，t，（CH2）13CH3］，1.24－1.29［52H，m，NCH2CH2（CH2）13CH3］，1.29［3H，d，NHCHCH3］，1.53［4H，m，NCH2CH2（CH2）13CH3］，3.15［2H，t，NCH2（CH2）14］，3.20［2H，t，NCH2（CH2）14］，3.76［1H，t，NHCHCO］。

2.5 含人工受体的脂质体制备［8］

称取肽脂质和人工受体（摩尔比为20∶1）溶于氯仿，氮气流吹扫下使氯仿挥发制成薄膜，30℃真空干燥彻底去除残留氯仿，加入10 mL HEPES缓冲液（10 mmol·L－1），漩涡振荡5 min，再用杯式超声仪超声处理5 min（60 W、脉冲间隔1 s），得到相应的混合脂质体悬浮液。取混合脂质体悬浮液样品采用质量分数为3%的磷钨酸溶液负染，透射电子显微镜下观察制备好的脂质体状态。

2.6 乳酸脱氢酶（LDH）活性的测定

乳酸脱氢酶的底物NADH在340 nm处有强吸收，NADH被LDH氧化成NAD后，特征吸收峰消失;因此，可以通过紫外可见分光光度法测定NADH变化，从而计算LDH的相对活性;LDH相对活性以铜离子存在和不存在时酶促反应初速度的比值来度量［6－8］。

3 超分子体系的组装与功能检测

3.1 超分子体系的组装机制

肽脂质分子如同磷脂分子一样，可以制备形成双分子膜（脂质体）结构。本研究所用的肽脂质含有类似肽键的结构，这些肽键在肽脂质聚集时，可以通过彼此间的氢键，起到稳定脂质体的作用。人工受体具有长链疏水基团，在制备脂质体过程中，可直接组装到脂质体中。

在HEPES（pH 7.0）体系中，肽脂质N+C5Ala2C16头部的季铵盐结构使脂质体表面带有正电荷，可以通过静电作用吸附带有负电荷的乳酸脱氢酶。二价铜离子作为乳酸脱氢酶LDH的抑制剂，通过与LDH结合而聚集到肽脂质形成的脂质体上;肽脂质人工双分子膜、人工受体、效应器分子（LDH）、中间信使（Cu2+）4种组分组装形成超分子体系。

3.2 信号分子——吡哆醛磷酸（PLP）对超分子体系的识别与结合

吡哆醛磷酸（PLP）在HEPES（pH7.0）缓冲溶液中带有负电荷，当PLP与肽脂质脂质体溶液混合时，由于静电作用，PLP会吸附到带有正电荷的脂质体表面;PLP和肽脂质体的作用特点如图3。

图3 信号分子PLP溶液和脂质体加PLP溶液的紫外－可见吸收光谱

在图3中，PLP在HEPES缓冲溶液中有2个吸收峰（如图3（a）），分别位于325 nm和389 nm，并且在389 nm处吸收更强。单独的脂质体在300 nm至500 nm范围内没有明显的吸收峰（如图3 （b））。当脂质体的HEPES缓冲溶液与不同浓度的PLP（HEPES缓冲溶液）混合后，只能检测到信号分子在395 nm处的特征吸收峰，并且吸收值随PLP浓度逐渐增加（如图3（b））。由图3结果可知，PLP与带正电荷的脂质体相互作用，造成了PLP在325 nm的吸收峰变化;同时造成389 nm吸收峰红移到395 nm。

实验结果表明，由于静电作用，PLP会自动向脂质体聚集，完成超分子体系的自组装。

3.3 吡哆醛磷酸（PLP）调控超分子体系的功能状态

在HEPES（pH 7.0）缓冲液条件下，超分子体系中的乳酸脱氢酶（LDH）由于铜离子抑制，其相对活性仅为11.6%，即超分子体系的效应器（酶）处于关闭状态（off state）。

向以上体系中加入PLP后，测得LDH的相对活性为83.0%。即加入PLP后，效应器（酶）的活性从11.6%上升到83.0%，效应器（酶）处于工作状态（on state）。

以上实验结果表明，PLP可以作为信号分子调控效应器（酶）的活性状态;达到了利用超分子体系模拟完成生物体系中G蛋白耦联受体型信号转导过程的设计目标，其调控过程总结于图4。

图4 利用超分子体系模拟生物体G蛋白耦联受体型信号转导过程示意图

Cu2+是LDH的竞争性抑制剂，体系中Cu2+的浓度直接调控着酶的活性。当体系中不存在信号分子时，Cu2+结合并抑制LDH的活性，体系处于OFF状态（如图4左侧）。当体系中加入信号分子后，信号分子与受体形成希夫碱，希夫碱与Cu2+形成稳定的金属配合物（如图4的放大部分）。由于希夫碱与Cu2+结合能力更强［9］，可以从乳酸脱氢酶LDH上夺取Cu2+，解除Cu2+对LDH的抑制，实现乳酸脱氢酶的激活，使体系处于ON状态（如图4右侧）。

4 结语

（1）利用超分子体系可以有效进行生物体G蛋白耦联受体型信号转导过程的模拟，通过信号分子来调控效应器（酶）的催化活性。其核心工作是确定生物体系信号转导过程的关键元件与信号转导机制，从化学生物学角度设计与合成对应组件，利用自组装方法构建超分子体系模拟并完成人工信号转导过程。

（2）以构建并获得的超分子体系为基础，可以开发出用于酶活性控制的超分子开关器件，并进一步用于酶工业的催化控制。

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Investigation of Bio－inspired Signal Transduction in the Supermolecular System

LIU Bao－quan，WANG Jian－feng，SHI Tai－de，FAN Sheng－di
（Key Laboratory of Bio－Chemistry Engineering of the State Ethnic Affairs Commission－Ministry of Education，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

A supermolecular system with intermolelular communication activities was constructed，inspired by G－protein mediated cell signal transduction.A cationic peptide lipid，N，N－dihexadecyl－Nα－［6－（trimethylammonio）hexanoyl］－alaninamide bromide（N+C5Ala2C16） and an artificial receptor were synthesized with 1－hexadecylamine and 1－bromohexadecane as starting material through five steps，including substitution and condensation reactions.A selfassembled supermolecular system was obtained，based on liposome with positive charges.The relative activity of LDH was 11.6%due to the inhibition of Cu2+in the absence of the signal molecules.In that supermolecular system，pyridoxal 5'－phosphate acted as the artificial signal，Cu2+acted as a mediator.When the signal molecule，PLP，was added to the supermolecular system，PLP attached to liposome surface，and reacted with the amino group of the artificial receptor，and formed the Schiff base.The Schiff base could withdraw the copper cation captured by LDH，and led to the recovery of LDH activity，up to 83.0%，which has been inhibited by copper cation ever.The given results showed that the supermolecular system finished the signaltransduction from the signal molecules to the effect enzyme.A series of nanodevice，such as the supermolecular switch，will be created to control the enzyme activities.

supermolecular system;signal transduction;lactate dehydrogenase;nanodevice

O621.14

A

1009－315X（2011）03－0248－05

2011－03－18;最后

2011－03－31

国家自然科学基金资助项目（20872013）;教育部科学技术研究重点项目（2010－263）;国家民委项目（09DL08）;辽宁省教育厅资助项目（2009A154）;大连民族学院引进人才启动基金资助项目（20096102）。

刘宝全（1972－），男，蒙古族，辽宁北票人，讲师，博士，主要从事肽的功能研究与仿生化学研究。

（责任编辑 邹永红）