幽门螺杆菌VacA N端片段通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡①

杨 卓 张 艳 黎村艳 于 文 曹 斌 余敏君

(南华大学医学院病原生物学研究所,衡阳421001)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等上消化道疾病的相关病原体,空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)是其主要致病因子之一,因能使多种体外培养的真核细胞形成空泡而得名。VacA是一种AB型毒素,位于N端的A亚单位(p33,1-311氨基酸残基)是毒素活性亚单位,位于C端的B亚单位(p55,312-821氨基酸残基)是与宿主细胞结合的部位。Y e等[1]的研究表明,用表达N端478个或更多的氨基酸残基的重组质粒转染Hela细胞时VacA出现空泡活性,且VacA引起空泡样变性的最小片段为422个氨基酸残基。

为了进一步明确VacA单一毒力决定簇对GES-1细胞凋亡的影响,本研究将课题组先前构建的VacA N端真核表达载体转入GES-1细胞,观察其对GES-1细胞凋亡的影响,以了解 H.pylori入侵宿主后对宿主的损伤作用,并为在分子水平上阐明其致病性及其可能的致病机制提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1主要材料 E.coli JM109、pDsRed-Monomer-C1及其VacA N端真核表达载体均为本室保存,GES-1胃黏膜上皮细胞系购自中南大学湘雅中心实验室细胞库,倒置显微镜系日本Nikon公司产品,透射电镜为日产/H7500型,DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4连接酶购自Promega公司,质粒转染试剂脂质体2000购自Invitrogen公司,兔抗 H.pylori多克隆抗体购自Chemicon公司,FITC标记羊抗兔IgG购自碧云天公司,Hoechst 33342、Rho123染料系Sigma公司产品 ,Annexin-V-FITC-PI试剂盒、Caspass-3、Caspase-9 活性检测试剂盒购自南京凯基生物公司,人细胞色素C ELISA试剂盒购自广州欣博盛生物公司。

1.2方法

1.2.1重组质粒在GES-1细胞中的表达与鉴定 人胃黏膜上皮细胞(GES-1)培养于10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基,置于37℃、含5%CO2、饱和湿度的温箱中培养用于实验。……