一氧化氮对豚鼠耳蜗外毛细胞L-型钙通道电流影响的实验研究

曹玲 黎万荣

最近研究表明耳蜗中有大量的一氧化氮合酶(nitric oxide synthease,NOS)存在[1]，提示一氧化氮(NO)在耳蜗内有生物作用。耳蜗内的NO与耳蜗血流调节、内淋巴液离子稳定性和神经传导等生理过程有关，还影响内耳多种疾病的病理生理过程[2]。目前人们对内耳NO及NOS的研究大多仍集中在正常生理情况下的分布和功能特征方面，而对其在内耳病理生理与药理条件下的研究报道尚少见，如NO是否可以通过影响耳蜗外毛细胞表面的钙通道，从而调节外毛细胞的功能状态，影响某些内耳疾病的发生和发展等。本实验应用全细胞膜片钳技术观察NO供体之一L-精氨酸(L-Arg)对豚鼠耳蜗外毛细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响，以探讨NO能否通过耳蜗外毛细胞钙通道途径调节外毛细胞及内耳的功能。

1 材料与方法

1.1耳蜗外毛细胞分离 实验动物为40只杂色或白色豚鼠(由泸州医学院实验动物中心提供)，体重325±22 g，雌雄不拘。动物快速断头处死，取出颞骨，迅速打开听泡，置入已充氧的冷Hanks液中；解剖显微镜下仔细剔除耳蜗骨壳，尽量保持膜迷路完整；断开蜗轴，将耳蜗轻移入含胶原酶Ⅳ的D’Hanks液中消化10～20分钟；轻移入含钙的Hanks液中终止消化5分钟；轻移入预先用多聚赖氨酸处理过的浴槽中，解剖显微镜下微镊撕除螺旋韧带，剪碎基底膜，轻轻吹打后静置10分钟，使单离的外毛细胞贴附于浴槽底部；小心更换新鲜的浴液。选择贴壁良好、立体感强、表面光滑、胞核接近底部、胞内无布朗运动颗粒、胞膜完整有双折射现象的单离外毛细胞进行观察和实验。……