针康法对免疫抑制大鼠细胞免疫功能的影响

朱志中,唐强,颜培宇

针康法对免疫抑制大鼠细胞免疫功能的影响

朱志中1,唐强2,3,颜培宇3

目的观察针康法对免疫抑制大鼠模型血清白细胞介素-4(IL-4)及T细胞亚群的影响。方法将40只健康SD大鼠(雄性)体重200～250 g,完全随机分为5组:正常组、模型组、康复组、针康组、针刺组,每组8只。除正常组和模型组外,其他各组分别给予针刺或康复治疗,每天1次,治疗10 d后,取大鼠血清。用放射免疫法检测血清中IL-4含量及外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞的含量。结果模型组血清IL-4水平升高,与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)。康复治疗和针康法都可降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05);模型组大鼠CD4+T细胞水平下降,与正常组比较有显著性差异(P＜0.05);经针刺和康复治疗后,针刺组和针康组大鼠外周血CD4+T细胞水平明显升高,与模型组比较有非常显著性差异(P＜0.01)。实验各组CD8+T细胞水平于治疗前后无显著性差异(P＞0.05)。结论针康法能降低大鼠血清中IL-4的含量,显著提高免疫抑制大鼠低下的CD4+T细胞水平,提高机体的细胞免疫功能。

免疫抑制;针康法;白细胞介素-4;T细胞亚群;大鼠

免疫抑制现象存在于多种疾病状态中,如病毒感染、恶性肿瘤、不孕不育、脑血管病及艾滋病等。多表现为免疫功能低下、应答性淋巴细胞的数量减少、免疫抑制性因子活性增强。本实验以免疫抑制大鼠为模型,探讨针康法干预后免疫抑制大鼠免疫功能变化,为针康法临床治疗提供科学依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康SD大鼠(雄性)40只,体重200～250 g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(京)2007-0001)。

1.2 模型制作及分组 取鼠后,饲养环境控制室温(22±1)℃,12 h光暗交替(7:00～19:00照明)。进入实验室最初4 d为适应环境期,自由进食和饮水,并每天抚摸2～3 min,以适应实验人员操作。实验第5天,各组均腹腔注射新鲜配制的环磷酰胺注射液50 mg/kg,连续3 d,第4天加强注射1次,制成免疫抑制模型。采用数字随机法将40只大鼠随机分为5组:正常组、模型组、康复组、针康组、针刺组,每组8只。

1.3 干预方法

1.3.1 康复训练 ①滚筒训练:滚筒长100 cm,直径60 cm,中间被分为4个格,可同时训练4只鼠。底座有固定架,一端有手摇柄,可手摇控制转动速度,常规为10 r/min。将大鼠放入该器内可训练大鼠的抓握、旋转、行走等运动,每天1次,每次20 min。②网屏训练:网屏为50×40 cm金属网带,网眼为1×1 cm,网板的左右和上方都用25 cm高的木板框边,网屏距地而高度为80 cm,下方铺以12 cm厚的海绵。先将网屏水平放置,将老鼠放在其上,然后将其一端抬高,在2 s内将此屏变成垂直位,保持5 s训练大鼠的肢体抓握能力,每天1次,每次 20 min。

1.3.2 针刺

1.3.2.1 选穴及定位 选穴:百会及百会旁开0.5 cm相当于于氏头针的顶区,足三里、关元(注:针刺组和针康组均选用以上各穴)。取穴定位:参照“十一五”国家规划统编教材《实验针灸学》和《腧穴学》大鼠标准穴位图,定位及拟人对照法定位。膝关节后外侧腓骨小头下3.5 mm处定位足三里;在剑突和外生殖器连线的上6/7与下1/7交界处定位关元穴;大鼠头背部正中纵线与两耳连线的交点上准确定位百会穴。

1.3.2.2 针刺方法及针具 大鼠清醒固定,各穴进针3～10 mm,留针30 min。每天 1次,治疗 10 d。针具选择华佗牌30号1寸针灸针。

正常组、模型组不采用任何干预措施,康复组采用康复训练,针刺组采用针刺治疗,针康组先采用针刺治疗,然后进行康复训练。

1.4 标本采集 ①按0.35 ml/100 g大鼠腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后用负压采血管心脏取血5 ml左右;②采血后将采血管放入4℃冰箱静置6 h,取出后3000 r/min,离心20 min;③取尽量多每管中的上清液,放入小试管中。

1.5 指标检测及方法 血清白细胞介素-4(IL-4)的测定采用酶标试剂盒(酶联免疫吸附法ELISA);大鼠外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞的含量的测定采用酶标试剂盒(酶联免疫吸附法ELISA)。

每个标准品和空白孔做复孔。加入稀释好后的标准品 50 μ l于反映孔内、加入待测样品血清 50 μ l于反映孔内。立即加入50 μ l的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育45 min。甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30 s,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。每空加入100 μ l的亲和链霉素-HRP,轻轻震荡混匀,37℃温育30 min。甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30 s,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。每孔加入底物A、B各50 μ l,轻轻震荡混匀,37℃温育5 min。避免光照。取出酶标板,迅速加入50μ l终止液,立即在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

1.6 统计方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。不同组间比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA),方差齐时选择 LSD法,方差不齐时选择Dunnett T3法。

2 结果

2.1 不同干预方法对血清IL-4含量的影响 与模型组比较,针刺组无显著性差异(P＞0.05);与模型组比较,康复组和针康组有显著性差异(P＜0.05);康复组与针康组之间无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-4含量的比较(pg/ml)

2.2 不同干预方法对CD4+T细胞和CD8+T细胞的影响 与正常组比较,模型组大鼠CD4+T细胞水平及CD8+T细胞水平明显下降(P＜0.01);经针刺和康复治疗后,针刺组和针康组CD4+T细胞数量明显升高(P＜0.01),与模型组比较有非常显著性差异(P＜0.01)。实验各组CD8+T细胞水平于治疗前后无明显变化(P＞0.05)。见表2。

表2 大鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞的含量(%)

3 讨论

3.1 实验模型的选择 目前常用免疫抑制剂制备免疫抑制模型。环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物,具有广谱抗癌作用,是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一,毒副作用主要是免疫抑制。利用环磷酰胺制备免疫抑制模型相对成熟,模型稳定。研究表明,环磷酰胺制备的免疫抑制模型可以降低实验动物的脾脏指数、抑制淋巴细胞增殖,降低自然杀伤细胞活性、抗体生成细胞功能等。本实验选择相对成熟稳定创伤小的造模方法,观察针康法对免疫功能的影响。在剂量选择上,有报道用大剂量100 mg/kg或200 mg/kg[1-3]一次性注射制备模型,也有用小剂量多次注射的方法,剂量为20～80 mg/kg不等,注射天数2～5 d不等[4-9]。预试验发现,50 mg/kg注射量安全可靠,天数在4 d为宜,造模后实验大鼠出现食欲减退,毛色粗糙,部分大鼠出现血尿及乳糜尿。

3.2针康法对免疫抑制大鼠血清IL-4含量的影响IL-4曾被命名为B细胞生长因子-1。IL-4主要由活化的CD4+T细胞、肥大细胞和NK细胞产生,主要作用于B细胞,促进其分化和增殖,表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ),增强B细胞的抗原提呈作用,诱导IgE的产生。IL-4还作用于单核/巨噬细胞,抑制其产生IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子;协同IL-3刺激肥大细胞增殖和协同脑脊液刺激造血细胞增殖[10]。

本实验结果显示,模型组血清IL-4水平升高,与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)。康复组和针康组都降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平(P＜0.05)。

3.3 针刺结合康复训练对免疫抑制大鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞的影响 CD4+T细胞是不均一的细胞群,根据所分泌细胞因子的不同将CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞。目前已分别在小鼠和人类建立Th1和Th2细胞克隆。Thl细胞主要介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答,参与细胞免疫及迟发型超敏反应性炎症的形成,故也称之为炎性T细胞,可认为相当于迟发型超敏反应T细胞(TDTH细胞)。因而Th1细胞在抗细胞内病原体(包括病毒、细菌及寄生虫等)感染中发挥重要作用。Th2细胞的主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体,与体液免疫相关。CD8+T细胞又称细胞毒性 T细胞(CT L),参与抗病毒免疫、抗肿瘤免疫以及对移植物的排斥反应。CT L的主要杀伤机制为:①分泌穿孔素和颗粒酶,引起细胞溶解;②活化的CTL表达FasL,通过与靶细胞表面的Fas抗原结合,诱导靶细胞凋亡。

T细胞亚群的数量及活性是细胞免疫功能的直接反映。实验中模型组大鼠与正常组比较CD4+T细胞水平明显下降,提示造模后大鼠的细胞免疫功能受到抑制;与模型组比较,经针刺和康复治疗后,针刺组和针康组CD4+T细胞数量明显升高(P＜0.01)。说明针刺和康复训练能够显著提高免疫抑制大鼠的细胞免疫功能,具有增强免疫的作用。

本研究结果表明,单纯康复训练可以降低模型组大鼠血清IL-4的含量,单纯针刺治疗亦可提高模型组大鼠CD4+T细胞数量,而针康法的优势在于在降低模型组大鼠血清IL-4的含量同时亦可提高模型组大鼠CD4+T细胞数量而取得较好的治疗效果。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Cellular Immunity of Immunosuppressive Rats

Z HU Zhi-zhong,TANGQiang,Y AN Pei-yu.Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,China

ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on interleukin-4(IL-4),T lymphocyte subsets of immunosuppressive model rat.Methods40 healthy SD rats(male,200～250 g)was divided into 5 groups randomly:normal group(NG),model group(MG),acupuncture group(AG),rehabilitation group(RG),and acupuncture with rehabilitation group(ARG),8 rats in each group.Each group was treated by acupuncture or rehabilitation except the model or normal group,once a day for 10 d.Radioimmunoassay and malondialdehydein(MDA)technique were used to test the contents of IL-4 and T lymphocyte subsets in each group.ResultsThe contents of IL-4 of immunosuppressive rats can decrease significantly in RG and ARG(P＜0.05).The level of CD4+T lymphocyte increased more significantly in AG and RAG than in MG after the treatment(P＜0.01).ConclusionTang's Approach can decrease the contents of IL-4 and improve the level of CD4+T lymphocyte in rats.

immunosuppression;Tang's Approach;interleukin-4;T lymphocyte subsets;rat

[本文著录格式]朱志中,唐强,颜培宇.针康法对免疫抑制大鼠细胞免疫功能的影响[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):313—315.

1.教育部高等学校博士点专项科研基金(20092327110002);2.黑龙江省研究生创新科研资金项目(YJSCX2009-163HLJ)。

1.天津市环湖医院康复医学科,天津市 300060;2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江哈尔滨市150001;3.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨市 150004。作者简介:朱志中(1983-),男,黑龙江双鸭山市人,硕士研究生,医师,主要研究方向:神经疾病的综合康复治疗。通讯作者:唐强(1963-),男,教授,博士生导师,主要从事神经系统疾病中医康复方法研究。

R245,R49

A

1006-9771(2011)04-0313-03

2011-03-16)

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