E2F1基因在CLD新生鼠肺成纤维细胞中的动态表达及意义

赵诗萌，吴红敏，张良，张玲

（1.中国医科大学附属第一医院新生儿科，沈阳 110001；2.辽河油田中心医院儿科，辽宁 盘锦 124010）

E2F1基因在CLD新生鼠肺成纤维细胞中的动态表达及意义

赵诗萌1，吴红敏1，张良1，张玲2

（1.中国医科大学附属第一医院新生儿科，沈阳 110001；2.辽河油田中心医院儿科，辽宁 盘锦 124010）

目的通过检测E2F1基因在高氧致早产儿慢性肺疾病（CLD）新生鼠肺成纤维细胞中的动态表达，初步探讨E2F1基因在CLD肺间质纤维化发生发展过程中的生物学作用。方法 足月新生SD大鼠于生后12h内分别持续吸入85%高氧和空气，于3、7、14、21d随机处死动物后，无菌条件下采集肺组织，进行肺成纤维细胞的原代培养，免疫组化、Western blot法检测E2F1蛋白表达，real-time PCR法检测E2F1mRNA含量。结果 生后3d空气组和高氧组E2F1蛋白及mRNA的表达（蛋白：0.251±0.054，0.249±0.074；mRNA：0.0664±0.0034，0.0668±0.0037）无统计学差异（P>0.05）；生后 7d 时高氧组 E2F1蛋白及 mRNA的表达较空气组增加（蛋白：0.248±0.041，0.278±0.034；mRNA：0.0659±0.0031，0.0728±0.0047），差异有统计学意义（P<0.05）；14d、21d 时增加明显 （蛋白：0.243±0.077vs 0.328±0.057，0.241±0.038vs 0.377±0.063；mRNA：0.241±0.038vs 0.377±0.063，0.0655±0.0038vs 0.0750±0.0041，P<0.01）。结论E2F1异常高表达参与了高氧致CLD鼠肺成纤维细胞过度增殖的病理过程，在肺间质纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。

高氧；早产儿慢性肺疾病；E2F1基因；肺成纤维细胞

随着早产儿，尤其是极低出生体质量儿存活率的明显提高，因长时间吸入高浓度氧所导致的早产儿慢性肺疾病（chronic lung disease，CLD）已成为威胁早产儿健康和生命的首要疾病［1］。早产儿CLD的晚期病理结局是肺间质纤维化，表现为肺成纤维细胞（lung fibrolasts，LFs）过度增殖［2，3］，其细胞水平的发病机制目前尚不清楚。E2F1基因是细胞周期G1期向S期过渡的重要调控因子，在调节细胞周期进程中起着关键作用［4］。研究发现，E2F1基因的过表达能刺激细胞增殖，而E2F1基因与肺间质纤维化之间是否存在着某种关系，目前尚未见报道。本研究通过对CLD新生鼠不同发展阶段肺成纤维细胞中E2F1蛋白及mRNA的动态表达情况进行检测，探讨其与肺纤维化发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠2～3月龄，雌性40只，雄性10只，体质量210～260g，由中国医科大学附属盛京医院动物部提供。大鼠E2F1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。通用型SP系列工作液试剂盒（SP-9000）、DAB显色剂及碱性磷酸酶标记的二抗购自北京中杉生物公司。SYBR（R）ExScriptTMRT-PCR Kit扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备及分组：将足月新生SD大鼠随机分为空气组和高氧组。高氧组于生后12h内（连同母鼠）置于玻璃氧箱（60cm×50cm×40cm）中，持续输入氧气，维持FiO2在85%，用钠石灰吸收CO2，使其浓度<0.5%。温度22～25℃，湿度50%～70%，每天定时开箱30min，添加水、饲料及更换垫料，并与空气组交换母鼠以免因氧中毒而导致喂养能力下降。空气组置于同一室内空气中（FiO2=21%），饲养条件与高氧组相同。

1.2.2 肺成纤维细胞原代培养：分别于实验后3、7、14、21d处死动物后，无菌条件下采集肺组织，进行LF的原代培养，方法同文献［5］。待细胞铺满瓶底后按1︰2传代，收集第3代细胞用于实验。

1.2.3 免疫组化技术检测E2F1蛋白表达：取同代细胞接种于盖玻片上，第2日取出盖玻片用4%多聚甲醛固定。3%H2O2室温孵育10min，山羊血清工作液室温封闭20min后，加大鼠E2F1单克隆抗体（1︰50），4℃湿盒过夜。滴加生物素标记山羊抗鼠IgG（1︰200）15min，辣根酶标记链霉卵白素工作液15min，DAB显色。显微镜下观察并拍片，随机抽取每组动物各时间点培养的LF免疫组化爬片10张，每张爬片于光镜下（×400）随机取5个视野，应用美国Universal Imaging Porporation图像分析系统进行蛋白质半定量测定，应用Meta Morph软件分析阳性细胞的着色强度，以平均积分光密度值表示E2F1产物的强度、光密度值与阳性反应产物表达强度成正比。

1.2.4 Western blot法检测E2F1蛋白表达情况：从液氮中取出冻存的标本，加入细胞裂解液提取总蛋白，酚试剂法进行蛋白定量。SDS-PAGE凝胶电泳并转至PVDF膜。一抗为小鼠E2F1单克隆IgG抗体，4℃过夜，二抗（抗鼠，IgG，北京中杉金桥生物公司产品）37℃孵育2h，显色，观察结果。以β-actin蛋白为内参，采用GIS-2020凝胶成像分析系统扫描分析结果，对蛋白质含量进行密度分析，以相对灰度值代表蛋白质表达量。

1.2.5 Real-time PCR法检测E2F1mRNA水平：取各实验组细胞，RNAiso法提取总RNA，RT反应按说明书进行。以获取的cDNA为模板，应用Rotor-Gene2000荧光定量PCR仪，采用SYBR誖ExScriptTMRT-PCR 扩增试剂盒（TaKaRa，DRR053S）进行 PCR反应，反应按说明书步骤进行。引物如下：E2F1正义链为 5′CCAGGAGTGAGTCAGCAGC 3′，反义链为 5′CACCTCCCTCCACATCCC 3′，GAPDH 正义链为 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 3′，反义链为 5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGT 3′。反应条件：95℃ 10s，95℃5s，60℃20s，40个循环，融解曲线反应条件：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。同时检测 E2F1及GAPDH表达水平。E2F1mRNA的相对表达量=E2F1基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肺成纤维细胞的E2F1的蛋白表达

免疫组化的结果显示，E2F1主要在LF的细胞核中表达。生后3d时两组E2F1蛋白的表达无明显差异（P>0.05），生后7d时高氧组表达开始增多（P<0.05），14d、21d 时明显增多（P<0.01）。Western blot法的检测结果与免疫组化的结果一致。见表1、图1及图2。

表1各组L F s的E 2F 1蛋白表达免疫组化半定量分析（±s，n=10）T a b.1D y n a mi c e x p r e s s i o n o f E 2F 1i n L F s d e t e c t e d b y i mmu n o h i s t o c h e mi s t r y（±s，n=10）Group Day 3 Day 7 Day 14 Day 21Room air 0.251±0.054 0.248±0.041 0.243±0.077 0.241±0.038Hyperoxia 0.249±0.074 0.278±0.0341） 0.328±0.0572） 0.377±0.0632）1）P<0.05，2）P<0.01vs room air group.

2.2 E2F1mRNA的表达

生后3d，高氧组与空气组E2F1mRNA的表达量无明显差异（P>0.05）；生后7d时，高氧组E2F1的表达量开始增加（P<0.05）；14d、21d时明显增加（P<0.01）。见图 3。

3 讨论

研究表明，早产儿CLD晚期最主要的病理变化是肺间质纤维化，其结局为肺成纤维细胞的大量聚集和胶原等细胞外基质的过多沉积，主要表现为过度增殖的肺成纤维细胞沉积于肺间质或替代正常的肺上皮。细胞增殖在器官生长发育、损伤后的组织重建中发挥着重要作用，而细胞过度增殖则会导致异常的病理过程，给机体造成损害。因此，如何适时而又适度调控LFs的增殖，使之既不影响组织的修复，又不因增殖过度而纤维化，成为有效治疗肺间质纤维化的关键。解决这一难题首先要从细胞周期调控机制的研究着手。

E2F1基因是诱导细胞由G1期进入S期最重要的转录因子，通过调节一系列细胞增殖相关基因（如PCNA，C-myc，DHFR，B-myb等）的表达来控制细胞周期的进程［6］。在G1期中，cyclinD与CDK4结合，导致其活化，活化的CDK4可使视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）易感基因的蛋白产物磷酸化，失去抑制转录因子E2F1的作用，E2F1脱离Rb蛋白后激活并启动DNA合成，细胞继而越过G1/S控制点进入S期［7］。E2F1基因过表达能刺激细胞增殖。在人类很多肿瘤中已经发现E2F1的过表达加快了细胞从G1期进入S期的进程，导致细胞过度增殖和恶性转化，肿瘤形成［8～10］。在非肿瘤细胞的异常增殖过程中，E2F1基因也起着重要的作用。谢庆祥等［11］证实，E2F1基因参与了肾间质细胞增殖过程，尤其与肾纤维化进程密切相关。张怀军等［12］通过对正常皮肤、正常瘢痕组织和病理性瘢痕组织的E2F1的基因水平进行检测发现，E2F1基因在病理性瘢痕组织中表达增高，对瘢痕组织中细胞的增殖起着重要的作用。

我们在前期对高氧CLD鼠肺病理形态学的研究中发现，吸入85%的氧7d时，CLD鼠的肺组织开始出现纤维化的改变，14d时纤维化改变明显，21d时达到高峰［13］；流式细胞仪分析结果显示，随着高氧暴露时间的延长，LFs处于G1期细胞的比例逐渐减少，S期细胞比例增加，G2/M期细胞比例则无明显差异，说明高氧使肺成纤维细胞G1/S调控点的作用减弱［3］。本研究结果显示，自高氧暴露7d起，高氧组LFs的E2F1mRNA及蛋白的表达较空气对照组升高，且随着高氧暴露时间的延长，升高的趋势愈加明显，21d时达到高峰。说明高氧可使肺成纤维细胞中E2F1基因的表达增加，且其增加的程度与高氧暴露的时间呈正相关。E2F1的过表达使肺成纤维细胞G1/S调控点的作用减弱，更多的细胞越过了G1/S调控点，由G1期进入S期，进行DNA复制，肺成纤维细胞过度增殖，最终导致肺间质的纤维化。

本研究发现，在细胞周期中起关键作用的转录因子E2F1在CLD肺纤维化肺成纤维细胞的过度增殖中起着重要的作用，对研究CLD肺纤维化形成的基因表达调控机制具有重要意义。

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（编辑王又冬，英文编辑王又冬）

Dynamic Expression ofE2F1Gene in Lung Fibroblasts of Neonatal Rats with CLD

ZHAO Shi-meng1，WU Hong-min1，ZHANG Liang1，ZHANG Ling2
（1.Department of Neonatology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pediatrics，The Central Hospital of Liaohe Oil Field，Panjin 124010，China）

ObjectiveTo determine the dynamic expression ofE2F1gene in lung fibrolasts of neonatal rats with chronic lung disease（CLD），and to elucidate the biological effects ofE2F1in pulmonary interstitial fibrosis of CLD.MethodsFull-term newborn SD rats were continuously exposed to 85%oxygen（hyperoxia group）or room air（room air group）within 12hours after birth.The rat pups were randomly selected to be killed on postnatal day 3，7，14and 21，lungs were immediately resected under sterile condition and primary culture of lung fibrolasts was performed.The expressions of E2F1protein and mRNA in lung fibrolasts were determined by immunohistochemistry，Western blot and Real-time PCR，respectively.ResultsNo significant difference in the expressions of E2F1protein and mRNA was found between hyperoxia and room air groups on postnatal day 3（protein：0.251±0.054vs 0.249±0.074；mRNA：0.0664±0.0034vs 0.0668±0.0037，P>0.05）.Compared with room air groups，the expression of E2F1in hyperoxia groups began to decrease since postnatal day 7（protein：0.248±0.041vs 0.278±0.034；mRNA：0.0659±0.0031vs0.0728±0.0047，P<0.05）and significantly decreased on postnatal day 14and 21（protein：0.243±0.077vs 0.328±0.057，0.241±0.038vs 0.377±0.063；mRNA：0.241±0.038vs 0.377±0.063，0.0655±0.0038vs 0.0750±0.0041，P<0.01）.ConclusionAbnormality of E2F1expression is involved in the pathological process of the proliferation of lung fibroblasts in hyperoxia-induced neonatal rats CLD and plays an important role in lung fibrosis.

hyperoxia；chronic lung disease；E2F1gene；lung fibrolast

R563

A

0258-4646（2011）02-0109-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.003

辽宁省教育厅高校科研计划项目（2010599）

赵诗萌（1972-），女，讲师，博士.

吴红敏，E-mail：WHM406@163.com

2010-11-15