Lactacystin 诱导帕金森病大鼠黑质胶质细胞的变化

庄文欣 付文玉 杨 丽

(潍坊医学院医学研究实验中心; 潍坊医学院组织学与胚胎学教研室山东261053)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种以运动功能障碍为临床特征的中枢神经系统退行性疾病,主要临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常,其主要病理特征是黑质DA能神经元进行性变性及包涵体的(Lewy body,LB)形成。PD的发病机制尚不清楚,最近的研究结果表明:泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)功能下降、氧化应激和脑内炎症可能在黑质DA能神经元变性过程中起重要作用[1,2]。小胶质细胞是中枢神经系统内的固有免疫细胞,神经炎症的主要参与者,通过多种途径参与氧化应激、炎症等过程[3]。OX-42是小胶质细胞表面补体Ⅲ型受体的抗体,可以作为其高特异性、高敏感性的标志物。星形胶质细胞约占大脑皮质总细胞数的50%,为神经元提供结构及营养支持,参与突触形成、神经元的发育、神经元的物质代谢调节和神经信息调控。在病理情况下,星形胶质细胞增殖加速,合成并分泌多种免疫和炎症介质,参与抗原提呈[4]。胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是细胞骨架的中间细丝蛋白,特异表达于星形胶质细胞,或少量表达于其前体细胞。而核转录因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)是炎症反应中重要的炎性介质[5]。本实验通过观察蛋白酶体抑制剂Lactacystin抑制黑质蛋白酶体功能后小胶质细胞、星形胶质细胞、NF-κB以及DA能神经元的变化情况,为进一步阐明其在PD的发病中的作用,为临床治疗PD新靶点的选择提供实验依据。

材料和方法

1.实 验动物与主要试剂

健康Spraque-Dawley(SD)大鼠30只,雌雄不限,体重200-250g,潍坊医学院实验动物中心提供。蛋白酶体抑制剂Lactacystin(美国Cayman公司),阿朴吗啡(apomorphine,APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)多克隆抗体均为美国Sigma公司产品,小鼠抗大鼠OX-42单克隆抗体(美国CHEMICON公司),兔抗大鼠 GFAP多克隆抗体、小鼠抗大鼠NF-κB抗体均为北京中杉金桥生物技术公司产品。

2.动 物分组及模型制备

SD大鼠30只,水合氯醛腹腔注射麻醉后,固定于脑立体定位仪上,在无菌条件下,正中切开大鼠颅顶部皮肤,剥离骨膜,暴露前囟(十字缝)、后囟(人字缝),并确保在同一水平位置。参照Louis.Pellegrino等大鼠脑立体定位图谱,采用两点注射法制备大鼠PD模型。选择右侧注射坐标点为:(1)前囟后5.0mm,正中线右侧2.0mm,硬膜下8.0mm;(2)前囟后4.4mm,正中线右侧1.2mm,硬膜下8.0 mm钻孔。用微量进样器将10μg Lactacystin(20μl)注射至右侧黑质致密部及中脑内侧束,每个坐标点注射 Lactacystin10μl,注射速度为 1μl/min,注射完毕后留针10min,然后以1.0mm/min速度缓慢退针(约10min)。术毕,用医用明胶海绵填塞颅骨孔,缝合切口,放回笼中喂养。术后3周APO腹腔注射(0.25 mg/kg),观察大鼠行为学变化,若恒定转向损毁侧,且旋转圈数>120r/30min,则视为成功 PD大鼠模型。另取6只正常大鼠作为对照组,各组均于8周后灌注取材。

3.组 织标本的制备

动物深度麻醉后,从一侧颈总动脉灌注生理盐水50ml,后灌注4%多聚甲醛200ml。断头取脑,将脑组织浸入4%多聚甲醛中后固定过夜。一部分成功模型鼠的大脑组织经脱水、包埋,常规石蜡切片,片厚6μm。另一部分成功模型鼠的大脑组织经后固定后放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底,然后将固定的中脑组织经0.01mol/L PBS缓冲液冲洗后,行冠状连续冰冻切片,片厚20μm,放入-20℃冰箱内保存。取冰冻切片,采用SP法进行OX-42及NF-κB免疫组化染色,步骤如下:3%H2O2孵育30min,以消除内源性过氧化物酶的活性,正常羊血清封闭,室温,30min,倾去多余血清,分别滴加OX-42及NF-κB,4℃,过夜,滴加生物素化二抗,37℃,30 min,滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素,37℃,30 min,DAB避光显色,3-5min,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。各步骤之间以0.01mol/L PBS冲洗。PBS替代一抗作为阴性对照。阳性细胞胞质均染为棕色。对照组结果为阴性。取石蜡切片行 TH和GFAP免疫荧光染色。

4.结 果分析及统计学处理

黑质 TH、OX-42及 GFAP阳性细胞计数:各组大鼠选取6张以上切片,计数每张切片上注射侧和健侧阳性细胞总数。分别计数注射侧及健侧TH、GFAP、OX-42阳性细胞数 ,并以 Lactacysin注射侧阳性细胞总数/健侧阳性细胞总数×100%表示阳性表达的变化。统计学处理所有数据以 ¯x±s表示,使用SPSS13.0 for windows软件统计,进行计量资料的单因素方差分析。各组数据均以 P<0.05为有统计学意义,P<0.01认为有显著性差异。

黑质NF-κB的表达:每只大鼠选取黑质致密部,可见 TH阳性细胞的相邻切片5张,应用 Image-Pro Plus专业图像分析软件,分析各组大鼠双侧黑质NF-κB的积分光密度(IOD)值。并以注射侧IOD值/健侧IOD值×100%表示阳性表达的变化。统计学处理所有数据以 ¯x±s表示,使用SPSS13.0 for windows软件统计,进行计量资料的单因素方差分析。各组数据均以 P<0.05为有统计学意义,P<0.01认为有显著性差异。

结 果

1.大 鼠行为学检测

对照组大鼠活动自如,注射APO后未出现旋转运动。实验组大鼠1周时出现活动减少,对外界刺激无自主竖毛,逃避反应慢,3周时腹腔注射APO检测大鼠行为,实验组8只大鼠向损毁侧连续旋转,平均 129圈/30min,并出现嗅探、震颤、后肢挠抓、嘶咬异物、烦躁不安及激惹等现象,8周时同方法检测有11只大鼠向损毁侧连续旋转,平均216圈/30min。注射APO后大鼠出现向健侧旋转,旋转时身体侧曲成环状,头尾衔接,以健侧后肢为支点旋转。大鼠平均转速>5r/min,视为成功PD模型。实验组与对照组相比较 P<0.05。

2.黑 质 TH的表达

实验组大鼠健侧及对照组大鼠两侧黑质均可见大量密集的 TH免疫反应阳性神经元,胞体较大,呈梭形或椭圆形,胞浆着色(图2),实验组大鼠损毁侧黑质TH免疫阳性细胞数量较健侧显著减少(图3)。实验组损毁侧与健侧阳性细胞数之比与对照组双侧黑质 TH阳性细胞数之比的差异有统计学意义(P<0.01)(图 1)。

3.黑 质 GFAP的表达

对照组及实验组健侧 GFAP阳性细胞的数量较少,胞体呈星形,染色浅(图4),两模型组大鼠损毁侧黑质 GFAP阳性细胞的数量明显增加,突起变短,染色加深(图5)。实验组损毁侧与健侧阳性细胞数之比与对照组双侧黑质 GFAP阳性细胞数之比差异显著,有统计学意义(P<0.01)(图1)。

4.黑 质OX-42的表达

对照组大鼠和实验组大鼠健侧黑质OX-42阳性细胞呈典型的“分枝状”,突起较长,胞体较小(图6);实验组大鼠损毁侧黑质OX-42阳性细胞数量明显增多,胞体增大,突起变短,增粗,呈现典型的"阿米巴状"(图7)。实验组损毁侧与健侧OX-42阳性细胞数之比与对照组双侧阳性细胞数之比有显著差异,有统计学意义(P<0.01)(图1)。

图1 各组大鼠损毁侧与健侧黑质 TH、GFAP及OX-42阳性细胞数百分比之比较(损毁侧/健侧×100%)Fig.1 Comparison of the percentage of TH,GFAP and OX-42 positive cell in each group between the injected side and the normal side in the substantia nigra of the rats(injected side/normal side×100%)

5.黑 质NF-κB的表达

对照组大鼠黑质NF-κB的表达量较少,阳性细胞分布较稀疏,染色较浅(图8);实验组大鼠损毁侧NF-κB表达量明显增多,阳性细胞分布较密集,染色加深(图9)。实验组损毁侧与健侧的IOD值的百分比(156.362±4.22)与对照组 IOD值的百分比(84.139±2.868)相比较差异显著,有统计学意义(P<0.01)。

讨 论

泛素-蛋白酶体途径是生物体内蛋白质选择性降解的重要途径之一,存在于所有的细胞核和细胞质中,负责清除细胞内突变、损伤和异常折叠的蛋白质,其功能异常或衰竭将导致细胞内异常蛋白蓄积、细胞功能障碍,甚至细胞死亡[6]。蛋白酶体抑制剂Lactacystin是链霉菌的一种代谢物,是选择性的20S蛋白酶抑制剂,它及其活性中间体的β-内酯(1actone)可选择性和不可逆地结合于蛋白酶体的β5亚单位,从而抑制蛋白酶体多种肽酶的活性[7],最终导致UPS功能异常。最近的研究发现UPS对蛋白降解能力的破坏是PD发病过程中的一个重要因素[8]。本实验中我们将蛋白酶体抑制剂Lactacystin 20μl定向注射到大鼠黑质及中脑外侧束,结果模型大鼠表现出典型的 PD行为学变化,旋转圈数的多少反映了黑质纹状体系统受损害的严重程度。免疫组化结果显示损毁侧黑质 TH阳性细胞数量显著减少,提示DA能神经元大量丢失。

近年来的研究表明,炎症反应在帕金森病中起着重要的作用[9]。小胶质细胞是中枢神经系统中的固有免疫效应细胞,它的活化在PD的发病机制中起重要作用。在成熟的脑组织中,静息的小胶质细胞呈特征性的分枝状形态,受到刺激后很容易被激活,形态学发生明显改变,从分枝状变成阿米巴样[10]。在 MPTP 小 鼠 PD 模 型、脂 多 糖(1ipopolysaccharide,LPS)模型[11]、鱼藤酮 (Rotenone)模型、6-OHDA大鼠 PD模型[12]中均能观察到小胶质细胞的激活,从而引发炎症反应。星形胶质细胞正常情况下处于静止状态,在中枢神经系统受损或炎症时,亦从静息状态快速向活化状态转变,细胞数目明显增加,活化的星形胶质细胞对神经元具有保护和毒性双重作用[13]。本实验中我们观察了由Lactacystin所致的 PD模型大鼠黑质胶质细胞的变化,结果发现实验组小胶质细胞及星形胶质细胞的激活、与DA能神经元变性、缺失并存,小胶质细胞形态发生明显变化,数量增多,星形胶质细胞数量明显增多,这与 Xie等[14]的研究结果基本一致,由此进一步证实了在PD发病过程中胶质细胞激活持续存在并与DA能神经元的进行性缺失有关。

NF-κB存在于神经系统几乎所有类型的细胞中,主要包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突细胞,在神经塑型、神经发育及神经变性等过程中具有独特作用。它的激活与PD的病理机制有关。王茜等[15]研究了由 MPTP制备的PD小鼠 NF-κB对 COX-2表达的影响,发现 PD组NF-κB表达明显升高。为研究由Lactacystin所诱导的 PD发病中NF-κB的表达以及与DA能神经元变性丢失的关系,我们观察了其在中脑黑质区的表达情况,结果发现实验组黑质 TH阳性细胞数减少,炎性介质 NF-κB表达量明显增高(P<0.01)。

总之,在本实验中我们利用蛋白酶体抑制剂Lactacystin脑内立体定位注射法制备大鼠偏侧PD模型,观察到实验组健侧致密部内DA能神经元数量较多,而注射侧除了DA能神经元数量减少外,还伴有小胶质细胞和星形胶质细胞的显著增生。激活了的小胶质细胞及星形胶质细胞,引发的炎症反应促使炎性介质NF-κB表达增强,引发DA能神经元的凋亡,而后者又能反过来进一步活化小胶质细胞,这样一种循环连锁反应可能被认为是致黑质DA能神经元损伤的重要因素。本实验结果为以胶质细胞、NF-κB作为靶点治疗 PD提供了一定的实验依据。

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图 版 说 明

图2 对照组TH阳性细胞。免疫荧光 ×400

图3 实验组损毁侧TH阳性细胞。免疫荧光 ×400

图4 对照组 GFAP阳性细胞。免疫荧光 ×400

图5 实验组损毁侧 GFAP阳性细胞。免疫荧光 ×400

图6 对照组OX-42阳性细胞。免疫组织染色 ×400

图7 实验组损毁侧OX-42阳性细胞。免疫组织染色 ×400

图8 对照组NF-κB阳性细胞。免疫组织染色 ×400

图9 实验组损毁侧NF-κB阳性细胞。免疫组织染色 ×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.2 TH-positive cells in the control group.Immunofluorescence×400

Fig 3 TH-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunofluorescence×400

Fig 4 GFAP-positive cells in the control group.Immunofluorescence×400

Fig 5 GFAP-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunofluorescence×400

Fig 6 OX-42-positive cells in the control group.Immunohistochemistry×400

Fig 7 OX-42-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunohistochemistry×400

Fig 8 NF-κB-positive cells in the control group.Immunohistochemistry×400

Fig 9 NF-κB-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunohistochemistry×400