植物转基因技术及其对籼稻品质改良的研究进展

李丹丹，王伟平 ，肖层林,*

(1湖南农业大学，长沙 410128；2湖南杂交水稻研究中心，长沙 410125)

转基因技术是利用分子生物学技术，将具有实用价值的外源基因导入另一种生物中，改造生物的遗传物质，形成新的生物类型。植物转基因工程的目标主要是实现对作物的抗虫、抗病、抗逆、耐寒、耐旱及品质改良，从而获得理想性状的新品系。1983年，Zambryski[1]利用农杆菌转化烟草获得了首例转基因植物。水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一。 随着人们生活水平的日益提高，对稻米品质的要求也越来越高，研发具有某些特定功能的功能性稻米也成为了水稻育种的目标。人们利用转基因技术已将多种基因转入水稻以改善某些性状，获得了一些在抗性、品质等方面有明显提高的转基因水稻材料。至今，国内转基因研究已将约200种基因在60多种作物上做过试验，在水稻方面已成功地选育了一系列转基因品系及材料。1986年Uchimiya等首先获得卡那霉素抗性的转基因水稻愈伤组织[1]。1988年Tofiyama等在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株[2]；1990年Datta等从籼稻品种Chinsurah Boro II中获得第一例转基因籼稻植株[3]。水稻已成为单子叶植物遗传转化的模式植物，为其它禾本科植物的研究奠定了基础。但是转基因水稻研究还有许多问题亟需解决，包括不同品种基因型差异大、遗传转化体系不稳定、遗传转化效率低等。

1 植物转基因方法的研究进展

根据转化系统的原理，转基因方法被分为三类：其一，植物自身生殖系统为媒介的转化方法，如花粉管通道法、浸泡法、细胞转化法等。其二，以质粒为载体的间接转化法，如农杆菌介导法等。其三，直接转化法，相比前两种转化方法，直接转化法不用任何载体，如基因枪法、脂质体转化法、PEG法、低能离子束介导法、激光微束介导转化法、电泳法和超声波法等。其中，基因枪轰击法和农杆菌介导法被广泛用于水稻转基因研究。

1.1 植物自身生殖系统为媒介的转化系统

1.1.1 花粉管通道法

基本原理是在植物授粉结束后，将外源 DNA沿着花粉管通道导入，经过珠心通道进入胚囊，对尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞进行转化。柱头切除法、花粉粒吸入法、柱头涂抹法等都是行之有效的操作方法。此法操作简便，易于掌控，不受操作地点限制，在大田、盆栽和温室中，只要具备有性生殖过程的任何植物都可以进行，能缩短了育种时间，但是受到开花季节的限制。

1.1.2 浸泡法

利用植物自身的物质运转系统，将转化外植体叶子、子房、胚珠、幼穗、胚、花粉粒、幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，通过渗透作用，把外源基因导入受体细胞，使外源基因与受体整合、表达。该方法工作效率高，可以进行大批量的受体转化工作，培养技术简单，但该方法存在转化率低，重复性差，筛选和检测困难等缺点。

1.2 以质粒为载体的间接转化法——根癌农杆菌法

农杆菌介导转化是一种天然的基因遗传转化方法，将外源基因插入农杆菌的质粒上，由载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中。20世纪80年代初开始根癌农杆菌转化植物研究，90年代获得了转化细胞或转基因植株。由于禾谷类作物不是根癌农杆菌的天然寄主，利用农杆菌进行遗传转化曾经存在争议。1994年，Hiei[4]等利用“超双元”载体，改善培养基成分，在培养基中加入乙酰丁香酮(Acetosyringone)，建立适宜的转化体系，有效地提高了农杆菌介导水稻转化频率，并提供了详细的分子生物学证据和遗传学证据。Raineri[5]等用农杆菌菌株A281转化粳稻(Oryza satJvaev，Nipponbare)的成熟胚，获得到抗卡那霉素的愈伤组织。Chart[6]等用水稻根系和未成熟幼胚作为外植体，通过农杆菌介导转化水稻，获得了可育转基因植株。Southern blot分析表明T-DNA上的基因可以传递给后代。陈美芳[7]等将反义Wx基因导入4个直连淀粉含量高的传统籼稻品种绿黄占、清芦占 11号、三芦占 7号和特青中，对成熟种子直链淀粉含量分析表明，部分转基因水稻植株的T1或T2代种子中的直链淀粉含量有不同程度的降低，最低已降至16.52%。陈秀花[8]等通过农杆菌介导，将反义 Wx基因导入籼型杂交稻的保持系中，结果表明，多数转基因水稻的直链淀粉含量出现不同程度的降低，最低下降至7%左右。

农杆菌浓度、共培养侵染方式、水稻基因型、转化受体、选择标记基因等都是影响农杆菌介导的因素。易自力[9]等对不同的籼稻和粳稻品种进行农杆菌介导转化，结果表明，籼稻品种在3种培养基(CC，NB，MS)上的平均出愈率和分化率分别为67.2%，42.0%；相比籼稻而言，粳稻的出愈率和分化率都比较高，分别为88.7%，62.5%。农杆菌浓度直接影响转化率，浓度过低时，不利于基因的转入；菌液浓度过高，菌体自身易聚结，影响其在外植体上的附着，而且容易损失愈伤组织，因此找到适合的浓度范围可以有效地提高愈伤转化率。黄红梅[10]等在研究农杆菌浓度对转化率的影响时发现：转化率基本保持稳定的农杆菌菌浓度 OD600为 0.145～0.190，转化率约为79%，超过最大值0.190时，愈伤组织生长受到抑制，死亡愈伤数增多，选择培养时出现农杆菌污染。外源基因是否导入愈伤组织与根癌农杆菌和愈伤组织的共培养时间密不可分。培养时间过长，难以抑制农杆菌大量繁殖，容易造成农杆菌污染。殷丽青[11]等对影响根癌农杆菌转化频率的研究表明：愈伤组织共培养时间以3 d为宜；在抑制农杆菌效果方面，羧苄青霉素优于头孢霉素，250～400 mg/L为比较适宜的浓度。农杆菌介导转基因常用的方法是共培养法，对共培养转化体系的转化因子进行优化非常重要。

1.3 直接转化法

1.3.1 电击法

借助高压的电脉冲作用击穿原生质体质膜，形成可逆性的瞬间通道，从而使DNA通过小孔进入原生质体内的转化方法。Ou—lee[12]等在电击水稻原生质体后获得了 cat(chloramphenicol aicetyl transferas氯霉素乙酰转移酶)基因的瞬间表达。该法的优点是操作简单，转化效率较高，电击后细胞仍然保持完整性，避免植物细胞释放核酸，适合于瞬间表达的研究，缺点是容易对细胞膜造成损伤，影响遗传转化效率。

1.3.2 基因枪法

将外源基因或DNA吸附在金属微粒上， 利用高压放电、高压气体或火药爆炸，将金属微粒高速射入植物受体细胞或组织中从而实现转化。吴家道[13]等将抗白叶枯病基因 Xa21利用基因枪技术导入三系杂交稻恢复系明恢63和保持系皖B中，获得转基因水稻系，经检测，用转基因水稻配制两系杂交到，杂交组着F1含有Xa基因，既抗白叶枯病，又有较大的增产潜力。基因枪法缺点就是试验成本高、转化频率低，较难导入大片段基因，拷贝数多，后代中容易丢失。

2 籼稻遗传转化体系的建立及优化

转基因技术是定向改良水稻品种特性，实现高效育种的重要方法，然而籼稻组织培养困难严重地限制了转基因技术在籼稻品种改良中的发展。很多学者针对籼稻的愈伤遗传转化体系作了研究，试图优化籼稻组织培养技术，提高籼稻遗传转化效率，以促进籼稻细胞工程育种的理论研究与生产应用的发展。

2.1 影响籼稻诱导率的因素

导致籼稻组织培养困难的因素有很多，基因型是影响籼稻愈伤组织诱导的因素之一。沈锦华[14]等研究发现：各种基因型水稻组织培养能力高低分别为糯＞粳/粳＞粳/籼＞籼型杂交稻＞籼。选择合适的外植体进行遗传转化也是建立籼稻转化体系的重要组成部分，幼穗、花药、幼胚、花药和成熟胚都可以作为遗传转化的外植体诱导愈伤，但是不同的外植体诱导的愈伤及愈伤分化能力不同。幼穗和幼胚是比较理想的转化受体，具有较高的脱分化与再分化能力，但是受生长季节限制，无法及时满足遗传转化中大量愈伤组织的要求，而成熟胚不受季节的限制，操作简单，能够满足大量愈伤组织的要求，被广泛地用作遗传转化的外植体。

此外，植物激素浓度也是影响籼稻诱导率的重要因素。刘雄伦[15]等研究发现，各种籼稻品种成熟胚愈伤组织诱导所需2，4-D浓度在1.0～2.5 mg/L之间，不同 2，4-D浓度处理之间的平均愈伤诱导率存在极显著差异，说明各个籼稻品种的愈伤诱导均有一个最适 2，4-D浓度。培养基是诱导愈伤组织的物质基础，水解络蛋白、脯氨酸、肌醇等都是培养基中的营养添加物。高丽丽[16]等研究发现，同一种营养添加物对愈伤诱导率在不同籼稻品种间影响差异极显著。此外，在细胞的悬浮液培养过程中，加入细胞分裂素类物质能够长期培养的籼稻细胞保持胚性。

2.2 影响水稻愈伤组织筛选的因素

诱导后的愈伤组织经过筛选后才能进行分化。因此提高筛选过程中愈伤再生频率是获得转基因苗的保障。愈伤组织在筛选过程中，很容易发生褐变，进而严重影响成愈率。顾之中[25]等对影响水稻愈伤组织发生褐变的因素进行研究，结果表明：水稻基因型的影响在所研究的诸因素中居首位。此外，不同基因型水稻愈伤组织发生褐变的褐化率差异很大。

诱导培养基中的合适的激素配比能提高愈伤组织再生。NAA，KT，BAP，TDZ等都是诱导愈伤组织再生的激素。田文忠[17]等对籼稻愈伤组织再生频率的研究发现，无论选用幼胚、成熟种子胚或经过继代培养的愈伤组织，在诱导培养基中加入NAA 和 KT不但可以显著提高籼稻愈伤组织的再生频率，而且还可以提高愈伤组织质量，形成致密、较硬，颗粒状结构的易分化的愈伤组织。

在水稻遗传转化过程中，不同的植物或同一植物的不同品种对筛选剂的要求可能不一样。目前，常用的筛选标记基因是 bar基因(除草剂抗性基因)和hpt基因。周玲艳[18]等对上述两个筛选标记基因的浓度和效果进行研究，不同水稻对筛选剂浓度要求也不同，当潮霉素浓度为50 mg/L时，粳稻农垦58S经过15 d左右筛选后，98%的愈伤组织褐化死亡，而籼稻培矮64S愈伤组织全部褐化死亡。

2.3 影响籼稻愈伤组织分化的因素

愈伤组织分化率是保证获得转基因植株的基础。籼稻组织培养的愈伤组织分化频率很低，一般在10%～15%，如何提高籼稻组织培养中植株的分化频率是目前生物技术中的亟需解决的难点。

基因型、外植体类型、温度、外源植株生长调节剂、蔗糖质量分数、继代培养、激素浓度等都是影响籼稻愈伤分化频率的因素。王慧中[20]等研究了植物激素、蔗糖质量分数、琼脂质量分数、pH值以及继代培养对愈伤组织分化率的影响。结果表明蔗糖2﹪、琼脂1﹪、PH6.0以及减少继代培养次数都有助于愈伤组织分化。杨跃生[21]等认为，在分化培养基中添加较高浓度的 CUSO4可提高绿苗分化率。此外有学者认为采用两步分化法[22]及脱水处理均可提高水稻愈伤组织再生率[23]。袁云香[24]等发现对已分化出绿点的水稻愈伤组织进行三步分化法，能显著提高成苗率。植物生长调节剂也是影响愈伤组织分化频率的重要因素。对愈伤组织采用一系列的激素筛选，最终得到一组最适合的愈伤分化成苗的激素比是很重要的。陈兴春[25]等对分化培养基中的激素浓度研究表明，细胞分裂素ZT和生长素IAA的比率为 100∶1最为合适；分化成苗率最高的培养基为MS + 2.0 mg/L ZT + 0.02 mg/L IAA + 3%蔗糖 + 0.8﹪琼脂。崔广荣[26]等研究了微量元素对籼稻愈伤组织分化成苗的影响表明：铁盐浓度高低对籼稻愈伤组织成苗率影响非常显著，最适合的铁盐浓度时 0.10 mmol/L，超过或低于此浓度时，尽管有绿点产生但是都不能形成绿苗。硼、碘、钼三种微量元素对分化成苗影响不大。

在愈伤组织分花前，对其采取恰当方式和适当时间的干燥有助于提高成熟胚的组织分化率。赵成章[27]等研究了干燥处理对水稻愈伤组织的再生及若干生理特性的影响，为干燥处理的应用提供了理论依据。马宏敏[28]等采用了滤纸干燥和自然风干两种干燥方法对成熟胚的愈伤组织在分花前进行干燥处理，结果表明：两种干燥方法均能显著提高水稻愈伤组织的分化率，滤纸干燥的最佳处理时间为4 d左右，自然风干干燥的最佳处理时间为1 h左右。赵成章[27]等研究认为，对愈伤组织分化前进行干燥处理，不仅能够吸收愈伤组织内的水分，使分化率显著提高，而且愈伤组织在干燥的滤纸上处于饥饿状态，一旦接到新鲜的分化培养基上，有利于愈伤组织细胞对培养基中养分的吸收和利用。

3 转基因技术对稻米品质的改良

3.1 营养品质改良

随着人们生活的日益改善，人们对稻米品质及其附加值的要求也越来越高。研究开发具有某些特定功能的功能性稻米是水稻育种领域较前沿的热点课题。通过转基因技术，有机地结合分子标记选择和常规育种等技术，利用Wx，Wx-hp，SBE，ISA，ALK，RSR2等基因，科研工作者已成功创造出外观品质、食味品质、营养结构等方面有显著改良的优质转基因水稻新品系。

为了改善稻米在蛋白质含量和氨基酸平衡方面存在的缺陷，提高稻米中赖氨酸和蛋白质含量，人们常将蛋白质中赖氨酸含量较高的豆类蛋白质基因转入水稻中以改良其营养品质。赖氨酸是蛋白质含量第一限制性氨基酸，提高赖氨酸含量，可以提高蛋白质的转化率，改善稻米的品质。Zheng[29]等通过 PEG诱导法分别将菜豆和豌豆的球蛋白基因导入水稻中 在水稻种子的内胚乳中表达 ，其中菜豆球蛋白约占内胚乳蛋白质总量的 4%。Momma[23]等通过电击法将大豆球蛋白基因(AlaBlb)导入水稻中，使大豆球蛋白的量约占种子蛋白质量的4%～5% 达 40～50 mg/g 蛋白质。很多学者除将豆类蛋白基因转入水稻中外，将其它植物的基因导入水稻中，以完成对水稻蛋白质和氨基酸含量的改良。起登凤[30]等将通过农杆菌介导将马铃薯特异水溶性蛋白基因SB401导入水稻，转基因植株的赖氨酸含量提高了20%以上。

在转基因技术操作中，研究人员不仅可以将单独的目的基因导入水稻中，还可以构建包含两个或两个以上理想的改良稻米品质的基因的载体，将其一起转入水稻中，更方面快捷地改良作物品质问题。王为民[31]等利用基因枪法将1个含高赖氨酸蛋白质基因和bar基因的植物表达载体，分别导入籼稻中优早5号幼胚和龙特甫B成熟胚诱导的愈伤组织中，经检测种子蛋白质含量和赖氨酸含量均有所提高。将改善稻米品质与抗虫基因的两个基因同时导入同一水稻品种中，既改善了稻米品质，有提高了水稻抗虫能力。孔维文等[32]利用基因工程技术将CaMU35S启动子引导的半夏凝集素基因(PTA)和水稻胚乳特异表达启动子(Glutelin-BI promtoter)引导的马铃薯高赖氨酸蛋白基因(SB401)同时转入 1826成熟胚诱导的愈伤组织中，获得了同时含 PTA和SB401的转基因植株，既提高了1826的抗褐飞虱能力，又提高了赖氨酸含量。

除对水稻中赖氨酸和蛋白质含量进行改善以外，很多学者对水稻中淀粉含量及微量元素含量进行改善。陈美芳[7]等将反义Wx基因导入4个直连淀粉含量高的传统籼稻品种绿黄占、清芦占11号、三芦占7号和特青中，对成熟种子直链淀粉含量分析表明，部分转基因水稻植株的T1或T2代种子中的直链淀粉含量有不同程度的降低，最低已降至16.52%。

3.2 功能品质改良

在改善稻米中微量元素方面，瑞士植物研究所Ye利用农杆菌介导法获得了产生β-胡萝卜素的“金米”，其技术思路是将维生素A原(β-胡萝卜素)合成途径的3个关键酶：八氢番茄红素合成酶(psy)、细菌八氢番茄红素去饱和酶(crtI)、番茄红素 13-环化酶(1cy)同时导入水稻中，检测表明类胡萝I-素已在转基因粳稻台北309种子中形成，内胚乳呈黄色，部分种子内胚乳中的类胡萝h素含量高达1.6 mg/g，其中以β-胡萝卜素为主。利用水稻种子特异高效表达γ-氨基丁酸合成酶基因，培育富含γ-氨基丁酸稻米的转基因水稻品种，对于改善高血压患者膳食有重要意义。利用 TMT基因提高转基因水稻中维生素含量的工作，以及提高叶酸含量转基因水稻的研制工作也在进行之中[33]。总之，利用根癌农杆菌将水稻不具备的外源基因介导入转化水稻，能筛选获得一些在品质方面有改良的水稻新材料或新品系，该方法能更好地促进水稻育种技术的发展。

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