血管内皮前体细胞在糖尿病足治疗中的应用

丁浩，张文健，温见燕，叶志东，庄乾淑，李建中，娄晋宁，刘鹏

糖尿病是严重损害我国人口健康的主要疾病之一，糖代谢紊乱所引发的血管病变是导致糖尿病患者致残和致死的主要原因。如何防治糖尿病血管病变所产生的并发症是糖尿病研究的热点课题。糖尿病足是糖尿病患者由于神经或血管病变导致足部缺血性坏死并合并感染的一种严重并发症。由于对其发生机制不完全明了，目前临床缺乏特异有效的治疗手段。近年来，自体干细胞移植成为治疗糖尿病足的一种新方法，但由于技术不成熟，机制不明了，疗效不确切，目前尚处于探索阶段。血管内皮前体细胞（endothelial progenitor cell，EPC）具有自我更新和定向分化成为血管内皮细胞的潜能，具有修复内皮细胞损伤、促进血管新生的能力，因此EPC 移植未来可能成为治疗糖尿病足的一种新方法。本文就这方面的研究进展作一扼要的综述。

1 糖尿病足的发生机制及传统治疗方法

随着人民生活水平的不断提高，糖尿病的发病率逐渐上升，我国糖尿病患者已经达到 9200万，而且还在以每年120万人的速率增加[1]。糖尿病产生糖代谢紊乱导致血管病变引发的一系列并发症包括视网膜病变、糖尿病肾病和糖尿病足。“糖尿病足”的概念由 Catterall等[2]于1956年首次提出，1972年将其定义为因神经病变而失去感觉和因缺血而失去活力，合并感染的足[3]。糖尿病足一般分为三种类型，即神经型、缺血型和神经-缺血混合型。在我国，糖尿病足以混合型为主，其次为缺血型，而单纯神经型比较少见[4]。

传统的观点认为：糖尿病血管病变的病理基础主要是动脉粥样硬化[5]。形成糖尿病足的根本原因是下肢动脉粥样硬化引起的慢性血管闭塞，导致下肢远端组织缺血坏死。动脉粥样硬化是发生在大血管的一种病变，以血管内皮细胞损伤，血管壁脂质沉积和平滑肌细胞增殖为主要病理改变。轻度血管闭塞者表现细胞变性，出现间歇性跛行、疼痛等症状；重度血管闭塞者导致组织细胞坏死，出现下肢远端组织溃疡或坏疽。有证据表明，糖尿病足的最终结局是：溃疡-截肢-死亡，并且早期筛查和有效治疗是影响预后的重要因素[6-10]。然而，除大血管病变外，糖尿病足患者也存在微血管的病变，表现为微血管舒缩功能障碍，凝血和纤溶活性的改变以及血管新生能力的降低[11-13]，导致病变血管远端的缺血区不能建立有效的侧支循环。

糖尿病足的传统治疗主要是内科的药物治疗和外科的下肢远端血流重建和截肢。药物治疗主要用于糖尿病足病变的早期和轻度患者。对于因动脉闭塞性病变导致的足部缺血需行外科处理，多采用血流重建手术以挽救缺血肢体，避免截肢或尽量降低截肢平面。但由于此类患者多年老体弱，并常伴有心脑血管病变，无法承受手术搭桥等刺激；另外，此类患者的下肢病变多累及小腿动脉，经常有部分患者缺乏远端动脉流出道，这些患者由于无法接受动脉搭桥或血管介入治疗而经常面临截肢的危险。

近年来有关干细胞的基础研究和临床实践为糖尿病足的治疗带来新的思路。干细胞移植治疗糖尿病足是最近几年刚刚开展的一项新技术，尽管还有很多尚未解决的问题，但这一技术业已展现出美好的应用前景。

2 自体干细胞移植治疗糖尿病足的临床应用

目前，临床干细胞移植治疗下肢血管病变有两种方法：自体骨髓干细胞移植和自体外周血干细胞移植。用于干细胞移植治疗的骨髓干细胞包括以下几种：骨髓单个核细胞（bone marrow-derived mononuclear cell，BMNC）、骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）和造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）。2002年日本学者 Tateishi-Yuyama等[14]在国际首次报道了应用患者自体骨髓干细胞移植治疗缺血性下肢血管疾病，取得了满意疗效，未发现不良反应，这也是首次在此领域进行的临床研究。试验最终纳入 45 例患者，其中 23 例单侧下肢缺血患者接受 BMNC 移植，对侧肢体注射生理盐水作为对照，另外 22 例双下肢缺血患者的两肢体分别接受 BMNC移植和外周血单个核细胞移植。采用踝肱指数（ABI）、经皮氧分压、静息痛、无痛行走时间、缺血性溃疡的改善及动脉造影作为评价指标，结果表明注射BMNC的肢体上述指标均有明显的改善。

2003年谷涌泉等[15-16]在国内首先开展了自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足的临床研究，发现大多数患者在治疗后达到了避免截肢或降低截肢平面的目的。Procházka等[17]报道，采用自体 BMNC 移植能改善糖尿病足肢体的缺血状况。从国内外临床应用情况来看，均达到了缓解症状、降低截肢平面甚至避免截肢的效果。

由于骨髓采集需硬膜外麻醉或全身麻醉，对患者的全身情况要求高，而且采髓量较大（最多需 500ml），使部分患者在心理上难以接受。近年来开展了自体外周血干细胞移植的研究，这种方法操作简单，患者易于接受。中国医学科学院天津血液病研究所黄平平等[18]报道，对一名确诊严重下肢动脉硬化性闭塞症患者，应用重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）进行外周血干细胞动员 5d后，用血细胞分离机采集干细胞并配成细胞混悬液，按 3cm×3cm间距肌肉注射进行双下肢移植，44 d 后给病情较重的左下肢第二次移植相同的细胞数。细胞移植一个月后末梢血流波幅和激光多普勒扫描血流灌注量较移植前显著改善，数字减影下肢动脉造影结果显示新侧支血管形成明显增加；细胞移植 3个月后，患者疼痛、患肢冷感、间歇性跛行、溃疡明显好转，左、右足踝肱指数（ABI）分别由 0.49、0.69 上升为0.50、0.85。

自体外周血干细胞移植同骨髓干细胞移植相比，具有采集的干细胞数量多、无抽髓的痛苦等优点，患者易于接受，尤其适合高龄、合并症多或不愿抽髓的患者，但是存在血液高凝和血栓形成的风险。

从理论上讲，干细胞中对糖尿病足具有治疗作用的细胞主要是 EPC。然而，EPC 在外周血干细胞中的含量不足1%，而在BMNC中的EPC 含量约占 3%。由于EPC 细胞含量非常有限，因此采用自体 BMNC 移植和外周血干细胞移植治疗糖尿病足的疗效也是有限的。当前，自体干细胞治疗糖尿病足的主要问题是：①机制不明了。虽然部分患者在接受自体干细胞治疗后糖尿病足的病情获得了改善，但是产生这种改善的机制并不清楚。由于在自体干细胞中，EPC细胞的含量是很少的，这部分细胞的治疗作用是很有限的，是否存在自体干细胞移植后分化成为EPC 细胞还缺乏实验证据；②技术不规范，疗效不确切。对采集的干细胞缺乏质量和数量的标准；干细胞移植的方法也不规范，包括：静脉输入，通过介入方法定向移植到糖尿病患者下肢动脉，局部注射到糖尿病足缺血区。由于对移植的干细胞缺乏标准，细胞移植的方法不一致，因此很难对疗效进行科学的评价。

3 EPC的研究进展

机体在缺血时会代偿生成新生血管。这种血管新生有两种方式：血管生成（angiogenesis）和血管发生（vasculogenesis）。前者是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；后者是指在原来没有血管系统的情况下，通过血管内皮前体细胞和造血干细胞的分化和相互作用产生新的血管[19-20]。传统观念认为机体出生后，循环系统已完全形成，因此认为由 EPC 再进一步分化成血管内皮细胞形成血管系统的过程不再存在，直到 1997年，Asahara等[21]从新生儿的外周血中分离并证实血液循环中存在EPC，这一观点才发生改变。

研究发现，人外周血 CD34+和VEGFR2+ 细胞在体外能够增殖转化为血管内皮细胞，因此认为：骨髓来源的表达 CD133+、VEGFR2+、CD34+的细胞具有分化为内皮样细胞的功能，并将这些细胞定义为EPC[22]。这些细胞分化时，CD133 逐渐转为阴性，而 CD31、血管性血友病因子（VWF）、血管内皮的钙黏蛋白等表达逐渐增多，形成成熟的内皮细胞[23]。目前认为：EPC 不仅参与人胚胎血管生成，也参与出生后的血管新生过程及机体、器官损伤后的血管再生与修复。

“治疗性血管生成”的概念是指将外源性促血管生成因子和（或）成血管细胞导入缺血组织内，促进其血管新生和侧支血管形成（包括血管生成和血管发生），以改善局部血流供应，达到治疗缺血性疾病的目的。外周循环的成熟EPC 具有趋化、黏附、迁移和整合等作用，它们能黏附到损伤的内皮细胞，并进一步分化为成熟内皮细胞[24]。Griese等[25]报道，在球囊导致的颈总动脉内皮细胞损伤动物模型上给予自身的EPC 后的第 4 天，就可发现这些细胞内衬于损伤的颈总动脉内皮层，其内皮修复率达 60%。He等[26]证实，在注射 EPC 四周后，可明显改善去内皮颈总动脉对乙酰胆碱的舒血管反应，血管舒张功能增强，表明移植的EPC 细胞在去内皮的主动脉发挥了生理调节功能。在小鼠后肢缺血模型也证实，注射 EPC能促进局部的血管新生并改善缺血组织的血液供应[27]。Kalka等[28]将人 EPC 移植给无胸腺裸鼠的缺血后肢 28 d 后，缺血后肢的血流量恢复至手术前的70%，而输注等量人微血管内皮细胞培养液或EPC 培养液的对照组分别只恢复到 27%和34%；在EPC治疗组，10/17 动物的后肢恢复了功能，而对照组的动物后肢功能恢复率仅分别为1/14和1/12；病理组织切片证实，人 EPC 参与了缺血区新生血管的形成。

EPC 不仅可以通过促进血管新生改善局部的血液供应，还可以通过分泌某些细胞因子营养末梢神经改善糖尿病足的周围神经病变和周围血管病变。骨髓来源的EPC 在糖尿病神经病变中具有血管再生和神经营养双重作用。研究表明，在许多神经病变中，血管功能的缺陷起到关键性作用[29]。许多经典的促血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）也具有神经营养作用；而许多神经营养因子，如神经生长因子（NGF）也具有血管再生作用。在链脲菌素诱导的糖尿病鼠模型上，坐骨神经的运动和感觉神经传导速度、血流和毛细血管密度都减小了，但在后肢注射骨髓来源的EPC 后，在EPC 注射的神经部位，多种血管再生因子和神经营养因子都显著增加，并且运动和感觉神经传导速度、血流和毛细血管密度都恢复到正常水平，证实骨髓来源的EPC能够改善糖尿病的神经病变[30]。通过在糖尿病神经病变部位特别是神经滋养血管预先和长期植入 EPC的促进血管新生和旁分泌作用，能够提高治疗效果。这些发现表明，EPC 移植是治疗糖尿病神经病变和血管病变的一种新方法。

生理状态下，机体外周血中 EPC 数量很少，约为2～3个/ml，在某些生理或病理情况下 EPC 可被动员入血发挥功能。有研究显示体育锻炼、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、雌激素、血管内皮生长因子（VEGF）等都能增加外周循环中的EPC 数量[31-35]。但在高龄、糖尿病和动脉粥样硬化等病理状态下，EPC 数量和功能都明显降低[36]，并且 EPC 特异分子如胎肝激酶（Flk-1）、CD133和钙黏蛋白（cadherin）的mRNA 水平明显低于健康对照组[37]。有报道，糖尿病患者体内 EPC 活性降低，并且直接与活性氧族生成增加有关，血循环中 EPC黏附和迁移能力下降[38]。类似的情况也发生在肥胖和代谢综合征患者中，说明此类患者自发的血管新生的潜能降低，这为自体干细胞移植提供了一定的理论依据。

4 EPC 治疗糖尿病足的前景

EPC 移植技术的出现，使其有可能作为未来治疗糖尿病足的一种有效方法。首先，EPC 移植可以修复动脉粥样硬化血管扩张后内皮细胞损伤，防止扩张后再狭窄的发生；其次，EPC 移植可以促进缺血区新生血管的生成，促进侧支循环的建立。因此，从理论上讲 EPC 移植治疗糖尿病足应该获得更好的临床疗效。尽管 EPC 治疗糖尿病足可能具有美好的应用前景，但还有若干技术问题有待解决：

⑴大量高纯度的EPC的获得

无论自体骨髓干细胞，还是自体外周血干细胞，EPC的含量都是很少的。提高 EPC的第一种方法是体外应用定向诱导分化技术将人的胚胎干细胞转化成为EPC，但目前还没有找到能够高效定向诱导制备 EPC的方案，并且异体干细胞治疗的安全性还有待评价。第二种方法是先分离纯化自体骨髓或外周血中的EPC，然后通过体外扩增技术大量制备 EPC。此方法的关键是 EPC的扩增技术。由于用来移植的细胞在体外扩增时不能使用胎牛血清等动物血清，有研究者尝试使用自体血清进行培养。结果发现可以达到与用胎牛血清培养基本相同的效果，且安全性更高，因此更适合应用于临床治疗[39]。另外，最近还发现一种新型生物多聚体chitosan-phosphorylcholine（CH-PC）能够增加 EPC的存活率，并促进其黏附和扩增[40]。尽管不断有新的方法，但体外扩增技术仍比较复杂，并且体外的长期培养增加细胞被污染的可能性，增加治疗的不安全性。第三种方法是应用干细胞技术制备 EPC：由于自体干细胞中 EPC的数量非常有限，因此应用 iPS 细胞体外定向分化为EPC 可能成为未来一种可行的策略。有研究显示，应用与人胚胎干细胞定向分化为EPC 相同的方法，iPS 细胞也能定向分化为EPC，且这两种来源的EPC的性质几乎一致，但 iPS 细胞诱导分化的EPC 在体内的功能还未得到评价[41-42]。总之，无论采用什么方法，都需要解决干细胞的体外扩增和定向诱导分化两个技术难题。

⑵细胞移植方式

采用 EPC 细胞治疗糖尿病足主要基于两个方面的作用：①利用 EPC 修复下肢病变血管的内皮细胞损伤；②利用 EPC 在缺血区局部形成新生血管，建立有效的侧支循环，改善血液供应。因此，细胞的移植方式可能直接影响治疗的疗效。前者适宜采用动脉介入的方式将 EPC 植入病变的血管，并局部停留一定的时间；而后者多采用缺血区局部注射的方式为佳。通过静脉输入的方式容易使 EPC 滞留在肺循环而影响治疗效果。

⑶建立科学规范的疗效评价体系

虽然自体干细胞治疗糖尿病足已经开始了临床试验研究，但必须明确这项技术还处于临床试验阶段，还不能作为临床糖尿病足的常规治疗手段，其有效性和安全性还有待临床的检验。因此，建立科学规范的疗效评价体系非常重要，其中包括：必要的临床前研究基础；临床试验单位资质的取得；医学伦理委员会的审批；科学的对照体系和系统全面的评价指标。

EPC 治疗性血管修复或血管生成技术已向人们展示出对糖尿病足的应用前景，虽然还有许多技术问题尚需解决，但这种方法较传统的治疗方法具有无可比拟的优越性。随着干细胞基础与临床应用研究的不断深入，相信在不久的将来，采用干细胞技术制备的EPC 移植治疗糖尿病足的应用研究一定会取得突破。

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