声动力学疗法抗肿瘤的生物学效应研究

王筱冰 综述 王攀 刘全宏 审校

声动力学疗法（sonodynamic therapy, SDT）是20世纪90年代由日本学者Umemura等首次提出的一种癌症治疗新方法[1]。它是指对肿瘤细胞先给予声敏剂，再用超声照射肿瘤细胞，产生一系列声化学反应，激活声敏剂分子进而杀伤肿瘤细胞。由于声敏剂的无毒或低毒性及其在肿瘤组织的聚集性，加之超声的可聚焦性、穿透性和照射部位的选择性，使SDT能够特异性地杀伤肿瘤细胞，而对周围正常组织的损害较小。与单纯超声相比，SDT降低了单纯超声致细胞死亡的作用阈值，对治疗肿瘤尤其是组织深部肿瘤有较强的靶向性和安全性。超声治疗装置简单，造价低廉，因此，SDT抗肿瘤研究具有重要的理论意义和潜在的临床应用前景。

1 SDT的作用机制

目前，SDT研究所涉及的超声波类型、超声参数国际上尚无统一标准，所应用的声敏剂结构不同、性质各异，所研究的生物系统模型包括在体和离体的不同肿瘤组织和细胞，因此SDT抗肿瘤的机制具有复杂多样性，包括热效应、机械效应和空化效应[2]。

1.1 热效应 由于生物组织具有声吸收特性，照射到人体组织的部分声能变成热能，使其温度升高。肿瘤组织受到超声辐射后，由于肿瘤细胞排列又很密集，其吸声系数约为正常组织细胞的2倍，因此大部分超声能量被肿瘤细胞吸收，使组织温度升高。加之肿瘤组织血管生长紊乱，血流缓慢，其温度升高不能通过血流向周围组织扩散，导致肿瘤组织对热的敏感性高于正常组织。当组织温度超过43℃可使肿瘤细胞pH值降低，蛋白质、核酸合成受到抑制，细胞膜通透性增高，溶酶体活性增强，肿瘤细胞结构遭到破坏，致使肿瘤细胞死亡。

1.2 机械效应 超声波是一种机械波，其在生物介质中的传播可带动媒质质点进入振动状态。当声强较低时，生物组织产生弹性振动，位移幅度与声强的平方根成比例；当声强足够大时，生物组织的机械振动则超过其弹性极限，造成组织断裂或粉碎，即为超声机械效应。当体外培养的离体细胞或在体肿瘤组织处于激烈变化的超声机械运动场中时，其分子结构和生理功能受到严重破坏。

1.3 空化效应 超声空化是指液体中溶解的气体即空化泡在超声波的作用下被激活，表现为空化泡的振荡、生长、压缩及崩溃等一系列动力学过程。空化过程能够将能量不断地聚集起来，在气泡崩溃瞬间将能量释放出来，形成异乎寻常的高温、高压、声致发光、冲击波、高速射流等极端的物理现象。超声空化一般分为稳态空化和瞬态空化。前者气泡沿平衡半径左右振荡，通常存在较长的时期，气泡振荡使周围液体流动产生机械剪切力。后者气泡生长到共振半径大小，然后迅速塌陷。空化泡塌陷时，可对气泡内及其周围介质产生大量声化学反应，直接作用或间接激活溶液中的声敏剂分子造成细胞损伤。

2 影响SDT效应的主要理化参数

2.1 超声参数 超声参数是影响SDT生物学效应的重要因素，在一定程度上决定了细胞的存活或死亡。过高的声功率导致细胞瞬时裂解，过低的声功率则没有抑制作用。超声损伤肿瘤细胞存在剂量阈值，当声波剂量大于此值时，随着声强加大和辐照持续时间延长，细胞存活率下降，而声强愈大，剂量-效应关系愈明显。另外，超声波的类型也是影响SDT疗效的因素之一，Sasaki等[3]研究发现，超声二次谐波和基波叠加可以增强声化学反应中的空化效应，可能是由于复频超声辐照时液体中的溶解气体向空化核内进行的定向扩散率比使用单频超声时大得多，从而加快了空化核的膨胀过程，使声化学产额增加，提高了声敏化效率。

Miller等[4，5]研究发现，超声的细胞生物学效应部分依赖于超声辐照时所采用的容器及其运动方式。旋转超声处理系统较静止系统导致的细胞裂解水平明显提高；超声作用介质中的氧气含量越高，介质的张力越低，表现为细胞对超声的敏感性越强。

2.2 声敏剂 声敏剂的选择必然影响SDT的抗肿瘤疗效。自发现超声激活血卟啉协同抗肿瘤作用以后，人们一直在努力寻找合适的声敏剂。有关新型声敏剂的应用、体内及体外实验、作用机制等方面的研究也在迅速发展，目前，SDT研究中所用的声敏剂大体可以分为3类[6]，包括卟啉类化合物、抗癌药物、抗炎症药物等。

理想的声敏剂不但要求化学的纯性和有效的声敏化作用，还要对肿瘤组织有较好的选择性，低毒或无毒，可以在体内迅速降解和排除等。目前认为较好的声敏剂仍是以卟啉类为主，与抗肿瘤药物相比，在没有超声作用下，卟啉是无毒的，部分卟啉及其衍生物在生物体的正常代谢中发挥一定作用。在自然界，卟啉化合物构成了血红蛋白、细胞色素及叶绿素等生物大分子的核心部分，参与生物体内一系列重要过程。卟啉类声敏剂是由4个吡咯环和4个次甲基桥联起来的大分子共轭体系，具有独特的生物活性和结构特征，与肿瘤细胞有特殊的亲和力。

有关声敏剂的在体实验研究涉及声敏剂剂量、声敏剂注入生物体内的方式（瘤内注射、腹腔注射和尾静脉注射）、声敏剂在体内的药代动力学特征、选择注射间隔时间进行超声辐照等，这些因素都能影响SDT治疗肿瘤的效果，但通常需要进行大量的基础实验才能筛选出声敏剂使用方案。

2.3 细胞模型 研究表明，恶性肿瘤细胞比正常细胞对超声的敏感性更强，其可能原因是由于肿瘤组织中处于分裂期的细胞比例高，DNA、RNA和蛋白质合成旺盛，因而为超声损伤细胞提供了更多的靶点[7]。另外，恶性肿瘤细胞对声敏剂的吸收通常强于正常细胞，由此奠定了SDT治疗肿瘤的靶向性和安全性基础。

不同肿瘤细胞由于在各自结构与功能上的差异而对SDT应答的敏感性有所不同。实验表明同等超声处理条件下，S180腹水瘤（sarcoma 180, S180）、艾氏腹水瘤（ehrlich ascites cancer, EAC）和小鼠肝癌H-22腹水瘤（hepatoma 22,H-22）对超声的敏感性依次为S180＞H-22＞EAC，这与三种瘤株的恶性程度以及肿瘤细胞膜的流动性不同相关[8]。Brayman等[9]对同步化和非同步化的CHV-79细胞研究发现，同种细胞处于周期的不同时相，表现出对超声的敏感性不同，并证实了细胞处于高密度下表现出对超声抗性，一方面，可能由于高密度细胞悬液增加了介质的黏滞度，抑制超声空化发生；另一方面，由于高细胞密度下细胞呼吸作用导致氧气和二氧化碳比例发生改变，空化核相对减少，细胞损伤降低。

3 SDT与细胞损伤

声动力引起的细胞损伤涉及细胞各结构，可表现为直接或间接地损伤细胞器、破坏细胞膜结构功能、改变细胞核DNA等。

3.1 SDT与细胞膜 细胞膜的选择性通透在细胞膜功能中具有很重要的地位。由于超声空化瞬间产生高温高压和声激流使细胞膜穿孔，从而增加了细胞膜的通透性。超声强度适宜时细胞膜产生的孔在一定时间内能完成自我修复，在一定程度上不会损伤细胞。超声强度很大时声孔不会完成自我修复，而导致细胞死亡。

SDT致细胞膜损伤的作用是多方面的。Tang等[10]研究发现，SDT可导致细胞膜严重受损，超声激活血卟啉作用于S180肿瘤细胞，处理后1h检测结果表明细胞膜脂质过氧化程度明显升高，磷脂降解加剧，游离脂肪酸水平增加，膜流动性降低，从而影响细胞正常代谢。SDT的作用机制可能是阻断了由表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）和Ras组成的生长信号传递通路以及抑制膜表面腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶的活性。Ogawa等[11]通过扫描电镜和透射电镜观察了低强度超声激活光敏物质部花青540（Merocyanine 540, MC-540）对HL-60细胞形态学变化的影响，认为单纯超声（255kHz，0.4W/cm2）或单纯MC-540（15μg/ml）没有细胞毒性效应，二者联合处理导致细胞膜表面出现大量大小不一的弹坑状凹陷，其机制可能与超声声孔效应相关。Bernard等[12]研究表明，低强度超声联合顺铂对人卵巢癌细胞的协同杀伤作用是由于超声增加了细胞内顺铂的含量。

超声波可以诱导细胞膜通透性明显增强，从而引起外源基因进入细胞。Watanabe等[13]比较了不同微泡造影剂（Levovist，YM454和MRX-815H）对超声介导人前列腺癌PC3细胞的基因转染效率，结果表明，有脂质包被的造影剂YM454和MRX-815H相对于无包被的Levovist更能增加细胞转染效率。超声转染主要是通过空化作用损伤细胞膜而实现，因而通过控制超声辐照对细胞膜通透性的影响程度便可控制基因片段转入受体细胞。Tata等[14]提出如何衡量超声致细胞损伤和致细胞死亡之间的平衡,寻找超声条件既能达到使细胞膜通透性增加以利于导入基因,又不致引发细胞不可逆性损伤,这是保证理想转化率的前提。Wei等[15]筛选不同超声参数应用于基因转染系统，在最佳参数下，超声有效介导了GFP转染到S180细胞中，转染率为（35.83±2.53）%，细胞存活率为（90.17±1.47）%，表明稳态空化下有利于基因转染，而瞬态空化造成细胞通透性急剧增强导致细胞损伤。

3.2 SDT与DNA损伤 DNA是生命信息的载体，是细胞中最重要的生物大分子之一。王君等[16]采用紫外可见光谱和荧光光谱研究了超声激活血卟啉（hematoporphyrin, Hp）对DNA的损伤作用。在超声和Hp的协同作用下，在可见光谱中DNA溶液的吸光度表现出明显的增色效应；在荧光光谱中DNA-EB溶液的荧光强度表现出明显的猝灭现象。DNA损伤程度随着超声辐射时间的增长和Hp浓度的增大而增加。溶液酸度对DNA损伤程度的影响较为复杂，当溶液为弱酸性和中性时DNA的损伤较为明显，弱碱性时对DNA的损伤程度则呈下降趋势。另外，在超声损伤DNA的同时，溶液中的Hp浓度也呈现出明显的下降趋势，说明Hp也受到了破坏，认为SDT对DNA的损伤也可能是其抗癌的有效途径。Milowska等[17]研究超声导致DNA损伤与超声空化产生H2O2，OH·等活性氧自由基相关，并且DNA损伤可以在处理后很快被修复。

4 SDT与细胞凋亡

细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，是多细胞生物体清除衰老和受损细胞器的一种自稳机制。作为近年来细胞生物学研究的热点课题，探讨细胞凋亡与细胞癌变的内在联系逐渐引起相关学者的关注。

诱导肿瘤细胞发生凋亡从而治愈肿瘤无疑是抗癌研究的新思路，实验表明声动力作用也能诱导肿瘤细胞发生凋亡[18，19]。2000年，Ashush等[20]首次报道低强度超声可以诱导人白血病细胞HL-60、K562、U937和M1/2发生凋亡。随后，各国学者对SDT诱导细胞凋亡及相关作用机制进行了大量研究工作。Lagneaux等[21]通过形态学分析、磷脂酰丝氨酸外翻、DNA片断化、线粒体膜电位、Caspase-3活性、PARP切割、bcl-2/bax比率、克隆形成能力等检测，同样也发现超声处理可以引发人白血病细胞系K562、HL-60、Kgla和Nalm-60细胞凋亡，且活性氧清除剂可减弱超声诱导的细胞凋亡，表明声化学作用氧化应激机制的参与，研究还提示超声诱导细胞凋亡有望成为一种特异有效的白血病体外净化方法。Yoshida等[22]在低强度超声结合香草素（DOX）协同抗肿瘤研究中发现，香草素增强了超声对U937细胞的杀伤和凋亡效应，其作用机制一方面是由于声孔效应增加了DOX在细胞内的含量；另一方面是由于DOX增强了超声的空化作用。Yumita等[18]研究超声结合Npe6对HL-60的凋亡作用，发现80μmol/L Npe6（Mone-L-Aspartyl Chlorin e6,NPe6）能够明显增强SDT诱导的细胞凋亡，并且可以被组氨酸所抑制，认为单线态氧在SDT中起重要作用。

Kagiya等[23]通过RT-PCR、Western blot检测到超声处理后U937细胞中血红素加氧酶-1表达量明显升高，且处理前后加入NAC，其表达减弱，提示氧化应激机制的参与。Tabuchi等[24]研究人白血病细胞Molt-4对低强度脉冲超声的基因应答变化，实验显示处理后（0.3W/cm2，1min）6h，几乎没有产生细胞裂解而细胞凋亡率达到（14±3.8）%；对22 283个基因进行微阵列芯片技术分析发现超声处理导致193个基因下调，201个基因上调了近1.5倍；下调基因基本与细胞的生长与增殖、基因表达和细胞发育相关；上调基因与细胞迁移、细胞形态维持和细胞死亡相关；表明超声处理可以引起多种基因表达变化。

刘全宏课题组在SDT诱导细胞凋亡研究中做了大量工作。2002年，在对EAC声动力治疗的过程中，不仅观察到细胞坏死的形态改变，还发现处理后的肿瘤细胞有核物质凝集、趋边排列以及凋亡小体形成等细胞凋亡特征，提示在SDT中并存着对肿瘤细胞的直接杀伤和通过诱导细胞凋亡的双重途径[19]。在EAC细胞凋亡机制研究中，通过检测Bax、细胞色素C和Caspase-3、Smac、Bid等与细胞凋亡密切相关的蛋白表达的动态变化，超氧化物歧化酶活性、膜脂质过氧化物含量变化，发现超声激活血卟啉诱导EAC细胞凋亡可能部分通过线粒体途径，且与肿瘤细胞受损后产生的氧自由基有关[25]。研究中还发现超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡具有一定的普遍性，诱发不同肿瘤细胞凋亡的最低用药剂量和超声强度及辐照时间均有所不同，在相同处理条件下，不同肿瘤细胞受诱导后表现出的凋亡比例和程度以及特征亦有差异。SDT在诱发S180肿瘤细胞凋亡的过程中，可引起细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平下降，而P53、Bax和Caspase-3表达增强，同时发现细胞凋亡的启动和执行与处理后细胞膜上的受体蛋白分布数量、活性有一定的关系，提出超声激活血卟啉可部分通过促进FasL失活以及激活死亡受体Fas系统，从而介导肿瘤细胞凋亡[26]。另外，研究还从形态学观察、生化分析、凋亡相关蛋白活性检测等方面证明了超声激活原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ, PpⅨ）也可通过诱导S180细胞凋亡的方式发挥其抗肿瘤活性，同时还表现出一定的时间依赖性效应。超声结合PpⅨ处理显著增强了Caspase-8、Caspase-3的蛋白表达活性，而且其下游的作用底物PARP也呈时间依赖性降解，说明PpⅨ介导的声动力作用可能与Caspase和PARP参与的凋亡信号通路相关[27]。超声结合PpⅨ作用于H-22肿瘤细胞后1～2h，细胞内活性氧含量明显升高，Bax、Bid发生转定位，Cyto c由线粒体释放到胞浆，引发细胞凋亡[28]。

5 前景与展望

声动力学疗法在非浅表肿瘤的非侵入性治疗中具有独特的优势，并具有良好的应用前景。由于SDT抗癌系统的多因素和复杂性，如不同的声敏剂、超声参数以及肿瘤细胞异质性等都可能影响其抗肿瘤疗效，所以将SDT应用于临床尚需展开和深入大量的基础研究。在SDT声化学研究中以寻找高效低毒的理想声敏剂和筛选超声波的最佳频率、声强、辐照时间等物理参数仍然是声动力领域的研究重点。结合细胞生物学研究进展，对SDT介导的细胞死亡模式需要进一步深入探讨，通过细胞水平或基因水平的调控增强SDT诱导肿瘤细胞死亡是研究的关键所在。随着SDT的深入研究，优化SDT治疗模式以及该疗法对机体免疫状态的影响等无疑将是SDT抗癌研究的新突破。

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