棘球蚴体外培养研究进展*

2011-02-11 19:20倪兴维李宏民者永辉闫鸿斌贾万忠
中国人兽共患病学报 2011年6期
关键词:棘球绦虫原代

倪兴维,李宏民,者永辉,闫鸿斌,金 科,贾万忠

2.西宁市动物卫生监督所,西宁 810003

棘球属(Echinococcus)绦虫的幼虫—棘球蚴(echinococcus or hydatid cyst)寄生于动物(包括人)体内,引起一类严重危害人体健康和阻碍畜牧业发展的人兽共患寄生虫病即棘球蚴病(Echinococcosis),又称包虫病(hydatid disease)。呈世界性分布,我国是棘球蚴病的高发区。目前世界上公认的棘球属绦虫有5种:细粒棘球绦虫(E.granulosus,Eg)、多房棘球绦虫(E.multilocularis,Em)、少节棘球绦虫(E.oligarthus,Eo)、福氏棘球绦虫(E.vogeli,Ev)和石渠棘球绦虫(E.shiquicus,Es)。细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、福氏棘球绦虫的幼虫均有感染人的报道,分别引起囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis,CE)、泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)和多囊性棘球蚴病,少节棘球绦虫和石渠棘球绦虫尚无人体感染的确切报告。目前我国存在有细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫3个种,其中细粒棘球绦虫分布最广,危害最严重。

棘球蚴寄生于牛、羊等反刍动物及人体内,成虫寄生于犬、猫等食肉动物,其生活史自身以及与宿主之间关系比较复杂,因此以活体动物为实验模型往往不利于研究寄生虫组成成分、致病机制、寄生虫与宿主之间的关系以及影响寄生虫生长的因素等。棘球蚴的体外培养使科学家便于研究棘球绦虫致病机制及其与宿主之间的关系等,从而为更有效地制定控制棘球蚴病流行的策略和寻找理想的防治手段等提供重要指导作用。下面就棘球蚴体外培养方法研究进展作一综述。

1 联合培养体系

1.1 “组织-碎片”培养体系(tissue-block system)

1995年,Hemphill等[1]对泡球蚴囊泡进行体外培养时,提出了“组织-碎片”培养体系,即从实验感染鼠的腹腔中分离出泡球蚴组织,剪成一些小碎片,在含有血清的复合培养基-RPMI 1640(含有10%胎牛血清、12 mmol/L Hepes、2 mmol/L谷氨酰胺、200 U/mL 青 霉素 、200 μ g/mL 链霉素 、0.5 μ g/mL两性霉素 B 和 0.5 μ mol/L β 巯基乙醇)中培养,从而观察泡球蚴的生长发育情况。研究结果表明:泡球蚴囊泡的整个培养过程可分为3个阶段,即最初20~25 d的囊泡快速生长期、第25~80 d的生长减慢期和80~100 d的生长稳定期。在培养过程中观察到泡球蚴组织块表面在一定时间后出现小的囊泡样结构,2~3 w后囊泡体积增大,释放入培养基中。形态学观察可发现,这些新形成的囊泡与直接从实验感染鼠腹腔或肝脏中分离的囊泡很相似,并且具有分化形成原头蚴的能力。研究还发现饲养细胞对囊泡的体外生长和繁殖具有重要的促进作用。Ingold等[2]应用此培养体系对泡球蚴囊泡和福氏棘球蚴囊泡进行了体外培养特性的比较。结果显示,后者的培养生长发育特性与泡球蚴囊泡所得结果相似,即福氏棘球蚴囊泡在培养初期,约50%的囊泡分化形成原头蚴,在培养4个月时也观察不到囊泡大量繁殖的现象,但囊泡体积在逐渐增大,由原来的0.5~4 mm增大到8~10 mm,培养结束时约有90%的囊泡孕育着原头蚴的形成,动物感染实验证实这些囊泡及其原头蚴能够在感染小鼠的腹腔中大量繁殖,仍具有感染性。

1.2 胶原膜培养体系(collagen layer system)

1996年,Jura等[3]利用寄生虫对中间宿主的亲器官性,提出了胶原膜培养体系,即在培养板底层和上层覆盖胶原纤维层,饲养细胞和泡球蚴囊泡位于两夹层中间。研究结果表明在肝细胞的培养条件下,泡球蚴囊泡在培养3 w之后,子囊以出芽的方式从包囊长出,数量由原来的52个增加到640多个,增加了11倍,体积由原来的平均127 μ m增大到平均为960 μ m,为原来的7倍 ,在 3或 4个月之后,大的囊泡穿过上层胶原纤维层,从而使大量小的新生囊泡释放到培养基中,此培养条件下囊泡能够生长繁殖至少12个月。而在没有肝细胞的培养条件下,在最初培养的几天能够观察到囊泡有适当的增加,约6 d后囊泡开始死亡,18 d后没有完整囊泡的存在,从培养开始到结束囊泡体积基本无变化。结果表明泡球蚴囊泡在饲养细胞的存在下具有体外生长繁殖的能力。国内陆家海[4]等人利用此培养体系的原理,建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法,并首次成功培育出一株人源细粒棘球蚴细胞系(13G-5)。

尽管如此,但上述两种培养体系也存在一定的缺陷。首先,在需要大量寄生虫材料时,无论是“组织-碎片”培养体系还是胶原膜培养体系所获得的囊泡的数量都是有限的,特别是“组织-碎片”培养体系;其次,这两种培养体系都一直存在宿主细胞的污染;最后,在这两种培养体系中,由于宿主细胞持续存在,不能清楚地区分已有宿主细胞因子对寄生虫生长是直接影响还是间接影响。

1.3 大规模液体培养体系(large-scale liquid cultivation system) 为了满足研究者对大量寄生虫材料的需求,Spiliotis等[5]对泡球蚴囊泡进行培养时,提出了第三种联合培养体系即“大规模液体培养系统”。与胶原膜培养体系相比,此体系没有胶原纤维层,但每周都要向培养基中加入少量用胰酶消化的新鲜肝细胞来代替死亡的饲养细胞,这样具有有丝分裂活性的肝细胞能够分泌一些有利于寄生虫生长的生长因子。研究结果表明:此培养体系可获得大量的成熟程度有所不同的泡球蚴囊泡,并且所培养的囊泡具有向原头蚴阶段生长发育的能力,但是在没有饲养细胞存在的条件下,囊泡就会迅速死亡。

尽管联合培养体系能够获得一些研究所需囊泡,但是要进一步研究宿主因素对于寄生虫生长的影响时,这些培养体系的作用还是非常有限的,因为体系中宿主细胞持续存在的问题未能得到解决(无论是从实验动物分离寄生虫组织时带入的,还是组织-碎片中存在的)。如果向培养基中加入或移去已确定的宿主因素来研究它们对寄生虫生长的影响,那就不能清楚地区分它们对寄生虫的影响是直接的还是由于污染的宿主细胞间接引起的。为了能够在完全没有宿主细胞存在的条件下来研究寄生虫的生长状况及寄生虫与宿主之间的作用关系等,使得另一种培养体系——“无宿主成分干扰”培养体系备受关注。

2 “无宿主成分干扰”培养体系

Seidel等[6-8]报道:在没有宿主饲养细胞的培养条件下,厌氧环境和向培养基中加入还原剂对短小膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、黄鼠膜壳绦虫(H.citelli)及缩小膜壳绦虫(H.diminuta)蚴的生长是必须的;Ivanchenko等[9-10]对曼氏血吸虫的研究表明:在体外将光滑双脐螺胚胎细胞作为饲养细胞时,血吸虫囊蚴就会迅速繁殖,并产生子代包囊,而在没有饲养细胞的条件下,囊蚴只有在厌氧和有还原剂条件下才能存活。

在此基础上,Spiliotis等[11]首次建立了对泡球蚴囊泡长期体外培养的“无宿主成分干扰”培养系统即无宿主因子污染及厌氧的培养体系。将联合培养条件下获得的囊泡分别在4种不同培养条件下观察泡球蚴囊泡的生长过程。研究发现泡球蚴囊泡能够在体外“无宿主成分干扰”条件下存活数个月,而在有氧环境中,2~3 w内囊泡迅速死亡;当囊泡在含有10%的血清培养基中培养时,能够存活数周,但不能够生长繁殖,而只有在宿主细胞存在的条件下,囊泡才能生长繁殖,并且可以观察到原头蚴的出现;在不含L-半胱氨酸而含β-巯基乙醇的培养基中培养时,泡球蚴囊泡也能够存活生长,但其数量比同时含有二者时低。结果表明:(1)血清的存在也是囊泡存活所必须的,(2)只有在特定培养基条件下泡球蚴才能够生长分化,(3)还原剂和无氧条件(即含有β-巯基乙醇、L-半胱氨酸、氮气、胎牛血清、青链霉素、DMEM)是泡球蚴囊泡生长繁殖所必须的。然而泡球蚴囊泡对有氧环境具有特殊敏感性的原因尚不太清楚,但已开展相关研究。Spiliotis[12]在研究中发现泡球蚴对氧敏感是因为缺乏有活性的过氧化氢酶,这一点在细粒棘球蚴的研究中也被证实[13];Matsumoto等[14]报道,多房棘球绦虫原头蚴的线粒体呼吸系统特别适应于厌氧环境,可以合理的推断泡球蚴其它组织细胞的线粒体呼吸系统也适应于厌氧环境。因此,在对体外培养时,对还原剂和厌氧环境的需要是必须的,但这并不意味着培养相关物种时就需要相同的培养环境,如膜壳绦虫属的微口膜壳绦蚴虫(H.microstoma)在体外培养时不需要还原剂或厌氧环境就能完全生长[15]。

在国内,温浩等[16]对泡球蚴囊泡进行体外培养研究表明:在有肝癌细胞系存在的条件下,体外培养后泡球蚴囊泡增多,到22 d时其数量是开始培养第3~4 d的6~7倍;随着培养时间的增加,囊泡的直径也在增加,最大直径达6 mm,小的约0.5 mm,在第22 d时约有30%为大的囊泡,70%为小的囊泡,并且一些具有出芽生殖能力,其形态介于原头蚴和囊泡之间。

较联合培养体系来说,“无宿主成分干扰”培养体系具有一些特殊优点。第一,在没有宿主细胞的条件下也能形成囊泡,这对于一些研究是非常重要的,也是必须的,如棘球绦虫基因组DNA的分离及cDNA文库的构建;第二,在培养基中加入已知的与寄生虫生长有关的生长因子,可以观察到其对寄生虫的直接作用;第三,通过对“无宿主成分干扰”培养得到的囊泡进行胰蛋白酶消化,可以得到无宿主细胞污染的原代细胞。但是,体外培养体系也存在一定的缺陷即主要用于感染后期的研究,而不能用于感染早期的研究。为了能够对棘球蚴感染中间宿主的早期阶段进行研究,有必要建立棘球绦虫原代细胞的培养体系,以便为棘球蚴病的控制与治疗提供重要理论依据和指导作用。

3 原代细胞培养体系

由于细胞培养对于分子生物学研究具有巨大的潜力,因此到目前为止已经有很多方法用于泡球蚴、细粒棘球蚴和其它绦虫蚴的原代细胞培养及其细胞系的建立。在所有相关研究中,都是采用体内培养的寄生虫材料用于原代细胞培养,但宿主细胞的污染仍然是一个非常严峻的问题。

Fiori等[17]报道,从细粒棘球蚴生发层细胞所分离的原代细胞进行长期培养时,所培养的细胞不具有其自身细胞的特征,而是具有哺乳动物成纤维细胞的形态特点,所培养的细胞的核型与宿主细胞的核型很相似。相关研究人员推测:Fiori等所得到的结果只是对宿主细胞的培养,而并非对细粒棘球蚴细胞的培养。Furuya等[18]对泡球蚴细胞系的建立进行了研究,但并没有证实这些泡球蚴细胞的组织器官来源。此外,其所培养的细胞形态与Fiori所培养的细胞形态相似,即所分离的细胞具有成纤维细胞样的形态学特点和宿主细胞样的核型。由于没有使用还原剂或厌氧培养体系,因此其很有可能也是对污染的宿主细胞的培养而不是泡球蚴细胞的培养。Dieckmann等[19-20]从泡球蚴和巨颈带绦虫(Taenia crassiceps)蚴的囊泡中分离出原代细胞,将其在体内培养时能够形成具有活性的囊泡,表明这些绦虫蚴囊泡具有巨大的再生能力,且生发层细胞是它们再生的唯一来源。Yamashitae等[21]将体内培养的泡球蚴囊泡作为寄生虫原代细胞培养的来源,并将培养温度维持在25℃,目的是限制宿主细胞的过度增长。通过这种方法能够使生发层细胞在体外存活达28 d,但不能生长繁殖,并且在28 d之后细胞就开始迅速衰亡。因此,可以说棘球蚴细胞体外培养面临的一个主要挑战就是:寻找适合于棘球绦虫蚴生发细胞生长的培养体系和消除宿主细胞的污染。

Spiliotis等[22]应用“无宿主成分干扰”培养体系培养的泡球蚴囊泡作为生发细胞的来源进行原代细胞培养,并且利用还原剂/厌氧培养体系,成功地克服了以上这些问题,建立了泡球蚴囊泡的原代细胞培养,并证实所分离培养的细胞是泡球蚴细胞而不是宿主细胞。研究结果表明:原代细胞在还原剂和厌氧环境条件及含有囊液的培养基中培养时,几周之内够就能分裂增殖,并形成小的细胞聚集体;当饲养细胞存在时,能够迅速增殖,约3 w时会形成细胞小体,到5 w时就会形成中心腔(原始腔),到6 w之后就能形成成熟的泡球蚴囊泡(含有角质层和生发层),并且这些新形成的囊泡具有感染性。这是该领域已取得的突破性进展,必将推动其它绦虫蚴体外培养技术的飞速发展。Albani等[23]用胰蛋白酶处理细粒棘球蚴来获得原代细胞,在含有还原剂和胰岛素的“无宿主成分干扰”培养体系中培养。结果表明:在培养24 h后,这些细胞分裂繁殖,贴壁生长;在48 h后可以发现其数量倍增,这表明原代细胞具有快速的增殖能力;在3~4 w后细胞聚集在一起,与邻近的细胞形成单细胞层,能够观察到小的聚集体粘附在培养皿底;当培养皿内表面完全被生长增殖的细胞粘附时,这些单细胞层就会形成一些小块,悬浮在上清中,当转移到新的培养皿中时,这些小块就会粘附在内表面,细胞开始繁殖,最后形成囊泡,但其是否具有感染性还需要进一步的研究。

4 培养体系的应用

近年来,随着棘球蚴体外培养技术的发展成熟,使棘球蚴致病机制、免疫应答及治疗药物研究等得到迅速发展,并取得一定的成果。Bernthaler等[24]利用体外培养体系,研究发现多房棘球绦虫中A-I结合蛋白转脂蛋白(Apolipoprotein A-I Binding Protein,EmABP)的编码基因Emabp在多房棘球绦虫的幼虫和成虫阶段均有表达,并且它具有一段信号肽,但这段信号肽在日本血吸虫(Schistosoma japonicum)中是缺少的。运用特异抗体和免疫沉淀技术发现EmABP存在于感染动物体内和体外培养的泡球蚴囊泡中,且它是胆固醇转运体-高密度脂蛋白的主要成分,主要存在于囊液中。此外,纯化的重组EmABP能与人血清中的A-I转脂蛋白相互作用,产生沉淀。因此,根据高等生物中A-I结合蛋白转脂蛋白的功能特点,表明EmABP在泡球蚴中的胆固醇和脂肪参与的各种机制中具有重要的作用。Hemphill等[25]利用“无宿主成分干扰”培养体系,研究发现泡球蚴磷酸葡萄糖异构酶(Echinococcus multilocularisphosphoglucose isomerase,EmPGI)存在于泡球蚴生发层、角质层及囊液中,除了具有糖酵解作用外,在刺激泡球蚴生长及泡球蚴在体内生长过程中诱导新血管的形成和调节宿主-寄生虫相互作用方面起着重要的作用。Reuter等[26-27]通过泡球蚴体外培养体系,证明两性霉素B不但可以有效抑制泡球蚴的生长,而且出现破坏囊泡作用的时间比阿苯达唑早,而同时使用这两种药物时却对囊泡的破坏有抑制作用。当停止加入药物时,囊泡出现再生长现象,而先后使用这两种药物比单独使用两性霉素B对囊泡的破坏作用明显。可以看出,通过体外培养体系,可进一步了解寄生虫的生长过程及致病免疫机制及药物作用机制等,对寄生虫病的防治具有重要意义。

5 结 语

由于寄生虫生活史较复杂,加之对营养要求高,因此体外培养比较困难,这也是该领域发展比较缓慢的一个主要原因。棘球绦虫“无宿主成分干扰”体外培养体系的建立极大地促进了相关的研究,尤其是对寄生虫-宿主相互作用机制及抗寄生虫药物的研究,而原代细胞培养体系的建立能够更好地从分子水平上对寄生虫进行相关的研究。随着各种培养体系的建立和改进,有希望对寄生虫各个发育阶段进行更深入细致的研究。

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