地方猪种冷冻精液在遗传资源保护中的利用前景

文│朱芳贤（全国畜牧总站畜禽遗传资源保存利用中心 中国农业大学动物科技学院）

刘丑生 赵俊金（全国畜牧总站畜禽遗传资源保存利用中心）

冻精保种对我国地方猪种资源保护，乃至猪联合育种工作将具有积极的社会意义和经济意义，希望各相关科研单位能够加大对这方面技术的研发与改进力度，以便能很好地适应现阶段养猪业的发展进程，充分发挥优良地方猪种优良基因的作用。

近来猪种资源数量持续下降，甚至有加剧的趋势。表现在：一是资源数量减少，据《中国畜禽遗传资源状况》（2004年）统计，全国有40%以上的地方猪品种群体数量有不同程度的下降，相继有14个地方猪品种被确定为濒危资源，有5个品种被确定为濒临灭绝资源，深县猪、项城猪、豪杆嘴型内江猪、大普吉猪等4个品种（类群）已灭绝；同时，品种内遗传多样性丰富度降低，许多地方品种（类群）的母猪数量急剧下降，公猪头数与血统数锐减，品种内的遗传多样性日益缩小，遗传变异日益枯竭，遗传基础愈来愈狭窄。

猪冷冻精液是遗传资源保护及育种的一种有效手段，然而目前养猪业中限制冷冻精液应用的因素很多，公认的主要原因有冷冻精液的受精率比新鲜精液低，不同公猪精液冷冻效果的差异大，每一次输精需要大量精子以及生产成本高等。其他因素有缺乏可靠的评定精液品质的实验室方法，难于掌握适时输精、精液冷冻和解冻的方法复杂，以及猪场不易得到液氮供应等。

虽然猪冷冻精液解冻后活力和受精能力在短时间内不可能有大的提升，但随着畜牧科技人员掌握冻精最佳输精时间技术的提高，相关设备的投入与改进，繁殖新技术的发展和运用，以及输精剂量和次数的增加，冻精的受胎率可达到理想的水平，从而使得目前看来受胎率不理想的猪冷冻精液在将来的遗传资源保护利用中有好的应用前景。

一、掌握适时授精时间提高母猪分娩率的可能性

随着畜牧科技人员对冻精最佳输精时间了解程度的提高，在使用冻精配种过程中可根据不同品种、不同胎次、不同年龄的母猪发情期长短作好发情鉴定；从母猪阴户红肿程度、颜色和干湿度黏液透明度和颜色，用手掌按压母猪臀部甚至骑在背部等方法来确定冻精最佳输精时间，从而提高冻精配种受胎率。

应用B超准确地鉴定母猪卵泡发育，掌握适时授精是提高冻精配种受胎率极其重要的措施。国内外的研究发现，B超在兽医疾病诊断、人工授精、胚胎移植中鉴定卵泡发育和早期妊娠检测均有快速、准确和精确的特点，B超和腹腔镜将成为未来人工授精中必备的工具。随着相关仪器价格的下降，国外一些先进企业在种猪繁殖育种过程中利用B超和腹腔镜的越来越多，相信国内对其应用也将越来越多。

Waberski等1994年的实验证明了对最佳授精时间的选择是提高母猪分娩率的关键因素之一，其实验结果为：授精时间在预计排卵前8小时以上时，受胎率为0%（0/16）；排卵前8～4小时，授精分娩率为70%（104/145）；排卵前4小时，授精母猪受胎率为100%、分娩率为88.1%；排卵后4小时内，授精受胎率为68.5%、分娩率为50%。Bolarin等（2006）研究了407头自发排卵母猪，每次授精只使用含10亿精子的冷冻精液，在接近排卵时间（超声波检查）时采取子宫深部授精，获得超过80%的产仔率和10头以上胎产仔数，也证实了准确确定发情排卵时间在授精中的重要性。

二、子宫深部授精方式的发展和运用

到目前为止，猪人工授精一般都是应用一次性海绵头的输精管在子宫颈深部授精。子宫颈内授精会有大量的精子（约25亿）输进子宫颈后部的皱褶，大多数的母猪在输精时和之后会表现出精液逆流现象，因而，大约30%～40%输入子宫颈管的精子，会在授精后1小时内从管中流出。同时，超过90%的精子在授精后2～3小时内被母猪的生殖系统——子宫颈、子宫、子宫输卵管连接部、输卵管壶峡连接部筛选排斥。这种精子的大量流失限制了能够到达子宫输卵管连接处的精子数。向成年母猪授精30亿冷藏精子，只有大约10万成功的达到了子宫输卵管连接处，大约1000个精子达到了输卵管峡部的精子储存库。此外，在精子质量差时这种损失更为严重，比如解冻后的精子。实际上，在输卵管中冻精的有效精子数一般比冷藏的低十倍。

随着输精技术的改进——输精器改进和手术、腹腔镜法等新的子宫角输精法（deep uterineinsemination，DUI）的采用，将精液输到子宫颈后更深部位能够使更多的精子到达子宫输卵管连接部。与常规的子宫颈内授精相比，子宫深部授精方式可以减少每次输入的冷藏精子数目。要达到子宫颈内授精（每次30亿以上精子）的受精效果，可以期待由每次输精1亿～1.5亿（子宫深部授精）得到。因此，这种方式被视为接近在生产条件下使用冷冻精液的实用、有效授精方式。特别是在精液有限，高质量的种公猪的精液需要得到尽可能有效的使用，或者保种需要的情况下。

1.输精器改进。Martinez 等（2001）采用一种柔性光纤内窥镜（长度：1.35米；外直径：3.3毫米；内直径：1.2毫米）实现了子宫角输精。这种输精装置插入到子宫角只需4.1±0.26分钟，应用这种子宫角输精法，输精效果（鲜精，每次10亿、2亿、0.5亿）与常规输精法（鲜精，每次30亿）在产仔率与平均窝产仔数上差异不显著；Rocaetal等（2003）采用激素诱导，一次子宫角输精使冷冻精液的输精量降为10亿/次，产仔率与平均窝产仔数分别达到77.55%，9.31头；Bolar′netal等（2006）对自然发情母猪进行2次子宫角输精（10亿/次），产仔率与平均窝产仔数也分别达到70.1%，9.18头；法国卡苏公司等在使用冷冻精液授精时改进了授精管，在海绵头授精管的内部设置一条细的导管，当授精管插入子宫颈深部后再推进内置的细导管，直到子宫角的弯曲部，这样精液能直接输入子宫内或子宫角，使用这种方法，据研究，用有授精能力的5亿～6亿精子和平常使用30亿精子无显著差异；Vazquez等（2001）在西班牙对329只经产母猪使用子宫深部授精（1.5亿冷藏精子/次）1次、2次或3次以及子宫颈内授精（30亿冷藏精子/次），产仔率为83.3%～87.3%，胎产仔数在9.2～10.4个；Day等（2003）在美国对105只经产母猪分别采用2次子宫深部授精1.5亿冷藏精子或者子宫颈内授精30亿冷藏精子，产仔率分别为83%、90%，二者没有显著差异。

2.外科手术植入。最近的研究显示，最少1000万冷藏精子通过外科手术植入子宫输卵管结合部，受孕率高达89%。

3.腹腔镜法。比起剖腹手术把精液直接输入子宫，腹腔镜法是一种创伤较小的手术，并且是可在大的养殖场中培训推广的技术。意大利完成的一项试验中，Fantinati等（2005）通过腹腔镜把精子输入接近子宫输卵管连接处，达到高受胎率所需的冷藏精子数量可以减少至每个子宫角500万个精子，这种腹腔镜技术已经被证明可用于受胎率更低的性控精液输精。最近还有报道称，使用腹腔镜法每个子宫角输入30万个性别分离精子，受孕率可达80%。

三、繁殖新技术的发展和运用

随着激素调控敏化子宫、单精子显微注射和克隆技术等繁殖新技术的发展和运用，猪的冻精有了更加广阔的利用前景，尤其是活体灭绝猪种的冻精更有价值。

1.敏化子宫。用激素让子宫变得敏感，提高受胎率的方法目前在养猪生产中有应用，比如在每份精液中加入催产素、前列腺素；一些试验在输精前加入人工合成的精浆制品；用不育的公猪与小母猪交配；用死精给小母猪输精等，目的都是试验激素对子宫的影响程度。施学仕（2007）在每份精液中加入律胎素（PGF2a）0.5～1.0毫升，1557头母猪产仔率与平均窝产仔数分别达到83.80%，10.15头，未添加者（1552头）产仔率与平均窝产仔数为86.80%，10.28头；精液中加入合成精浆MR-A Predil，296头母猪产仔率与平均窝产仔数分别达到83.80%，10.15头，未添加者（324头）产仔率与平均窝产仔数为82.07%，10.04头；据严家清（2001）介绍，在冷冻精液解冻后添加PGF2a，并且授精时间适宜，母猪的分娩率在80%～100% ，窝产仔数平均为8.1～11.7头。原因是精液经冷冻保存后，精子寿命缩短，若过早或过迟到达受精部位，均会失去受精的机会。由精液成分分析得知，鲜精内PGF2a的含量在200微克/升左右，冷冻后大部分被破坏，不能刺激母猪子宫和输卵管的蠕动，精子不能在正常的时间内游动到受精部位。

2.单精子显微注射。单精子显微注射是新兴助孕技术，出现于1992年，即在体外用机械注射方法将单个精子注入到卵子的胞质内，卵裂达一定程度时移回宫腔。

3.克隆技术。自从1997年Dolly羊诞生，克隆技术在整个生物界成为热点，2000年“阳阳”的问世，弥补了我国山羊克隆技术的又一空白。无论是胚胎克隆，还是体细胞克隆，都能发育为一个正常的个体。利用此技术，只要有濒危物种的胚胎细胞或者体细胞，那么都有可能使其生长为一个正常的个体。据2002年新加坡的一位学者报道，他领导的研究小组从已经灭绝10多年的Gaur calf标本的皮肤组织中，利用体细胞克隆技术克隆出了一只Gaur calf，使这一物种重新回到了生物界。这提示人们，某些已经灭绝的物种仍有可能会幸运地获得新生，给动物遗传资源的保护工作提供了一条新途径。

四、增加输精剂量和次数以提高猪冻精受胎率的效果

1.增加输精剂量。Waston & Behan（2002）在英国每次使用10亿精子通过子宫颈后授精技术给3240只经产母猪输精，产仔率为88.7%，胎仔数为12.1只，与子宫颈内授精的产仔率91.3%，胎仔数12.5个相比无显著差异。然而，Roberts & Bilkei（2005）在匈牙利和克罗地亚对1783只经产母猪分别使用10亿精子子宫颈后授精和30亿精子子宫颈内授精，尽管两者在产仔率上相似，但子宫颈后授精的母猪胎产数却明显少（前者10.2只，后者12.3只），这些结果与Rozeboom等（2004）于美国研究报道一致。当尝试更少输精数量时，即每次输精5亿精子，产仔率和胎仔数降低。说明冻精输精受胎率与输精剂量呈正相关。

2.增加输精次数。Reed等在1984年报告冻精输精受胎率与每个情期的输精次数也呈正相关。

五、结论

冻精保种对我国地方猪种资源保护，乃至猪联合育种工作具有积极的社会意义和经济意义。就现在很多地方猪种种群个体数量锐减，一些猪种灭绝，一些猪种面临灭绝的现状而言，希望各相关科研单位能够加大在这方面技术的研发与改进力度，以便能很好地适应现阶段养猪业的发展进程，充分发挥优良地方猪种优良基因的作用。各级部门应制作并保存地方猪种冻精，进行保种工作宜早不宜迟。