泛素-蛋白酶体系统与帕金森病

张 颖 高 鹏 许 颖 金 涛 (吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 300)

目前帕金森病(PD)的病因和发病机制尚不完全清楚，可能是遗传和环境因素相互作用的结果。泛素-蛋白酶体系统(UPS)在许多与细胞周期性增殖和凋亡相关的蛋白质的降解中起重要作用。UPS可清除真核细胞内突变、损伤及异常折叠的蛋白质，起到调控蛋白质和维持细胞内环境稳定的作用。在一些家族性PD中发现α-synuclein、parkin和UCH-L1发生基因突变，突变后的三种蛋白质与UPS的功能损害密切相关。尸检研究表明在散发PD患者的黑质中也存在UPS功能的降低。这提示UPS功能受损可能是不同病因作用的共同途径。本文就UPS与PD间关系的研究进展做一综述。

1 泛素-蛋白酶体系统与蛋白质的降解

许多有害蛋白质的降解过程是以蛋白质与泛素分子链的结合开始的，蛋白质与泛素分子结合是被蛋白酶体识别和降解的标志。靶蛋白的多聚泛素化过程是由一系列酶所介导的〔1〕。首先，泛素单体在ATP依赖的反应中由泛素活化酶(E1)激活。激活的泛素被传递给一种泛素耦联酶(E2)，然后通过ATP依赖的反应由一种泛素蛋白连接酶(E3)催化共价连接到靶蛋白上。上述反应重复进行，持续地将泛素分子加到靶蛋白上导致多聚泛素链的形成。多聚泛素化的蛋白质由26S蛋白酶体识别并降解。

蛋白酶体是在胞浆、内质网、核周区域及真核细胞的细胞核中发现的具有多催化作用的蛋白酶〔2〕。26S蛋白酶体由一个蛋白水解酶核心(20S蛋白酶体)及其调节亚单位(PA700)组成。20S蛋白酶体是由28个亚单位组成的四个环状结构轴向堆积而成的一个中空的圆柱状结构，可在其内部发生蛋白水解。PA700是26S蛋白酶体主要的调节亚单位，PA700至少含有6种ATP酶，执行至少3种ATP依赖性功能。PA700和20S蛋白酶体的结合利于蛋白质的进入，并为蛋白降解提供能量。26S蛋白酶体介导的水解终产物是小肽片段，这些小肽片段再由其它的蛋白酶进一步处理，产生它们的组成氨基酸。

在多聚泛素化的蛋白质进入蛋白酶体核心之前，泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)将多聚泛素链与靶蛋白拆开并分解泛素链以生成自由的单体泛素分子，后者再进入泛素循环〔1〕。由此可见，蛋白质的泛素化是泛素与泛素酶共同作用的动态过程。UPS的功能缺陷将导致蛋白质的异常积聚，导致细胞内不溶性包涵体的形成及细胞平衡和完整性的破坏。此外，蛋白质的积聚能导致Jun激酶和细胞凋亡的上调〔3〕。

2 泛素-蛋白酶体系统与遗传性帕金森病

2.1 Parkin突变与PD Parkin蛋白由465个氨基酸组成，其编码基因的各种缺失、删减及点突变可引起常染色体隐性遗传性少年型帕金森病(AR-JP)。

Parkin具有泛素蛋白连接酶E3的功能。在AR-JP患者脑中发现变性脑区和未受影响脑区parkin的水平和酶活性降低甚至缺乏〔4〕。Parkin突变导致不能清除其底物蛋白质，而正常情况下底物蛋白质可被parkin泛素化然后被蛋白酶体降解。在细胞系中表达突变的parkin可导致蛋白酶体活性降低、氧化应激水平增加及自由基介导的蛋白质和脂质的损害〔5〕。因此，parkin突变通过阻止底物蛋白质的正常泛素化及经蛋白酶体的降解，最终导致正常细胞功能的破坏和疾病的发生。

2.2 UCH-L1突变与PD UCH-L1异常的常染色体显性遗传性PD首先在一对兄弟间发现，遗传分析显示编码UCH-L1的基因发生错译突变，导致蛋白质内93位的异亮氨酸由蛋氨酸替代。UCH-L1属于去泛素酶家族，约占脑组织蛋白质总含量的1%，其功能主要是参与单体泛素分子的再循环〔6〕。UCH-L1突变病人脑中是否存在UCH-L1活性及表达的改变目前还不清楚。在大肠杆菌中表达突变的UCH-L1，结果显示这种酶的活性下降50%〔7〕。最近的一项研究发现，在大鼠中脑腹侧细胞的培养中用泛素乙醛阻断UCH-L1作用，可导致多巴胺能神经元出现剂量依赖性的变性并伴有泛素水平的降低及α-synuclein阳性包涵体的形成〔8〕。因此PD病人UCH-L1的突变可能导致酶活性的丧失，减少泛素自由单体的供应，不能正常标记底物蛋白质，从而影响蛋白质的清除，引起黑质病理改变。

2.3 α-synuclein突变与PD α-synuclein是Lewy小体中的主要组分。其基因的点突变A53T和A30P引起常染色体显性遗传性PD。α-synuclein的正常功能尚不完全清楚，推测与突触功能，例如突触可塑性及多巴胺能神经递质的传递有关。最近的研究提示α-synuclein还与多巴胺的生物合成有关〔9〕。也有证据提示α-synuclein能发挥分子伴侣的作用，参与异常蛋白质的再折叠及促进异常蛋白质进入蛋白酶体并在那里降解〔10〕。

在多巴胺能神经元和其他培养细胞表达突变的α-synuclein，能诱导神经元变性及α-synuclein和泛素阳性包含体形成，并且引起蛋白酶体活性的降低〔11〕。过表达野生型和突变型αsynuclein的果蝇出现多巴胺能神经元丧失和Lewy小体样包含体形成，共表达HSP70可以减轻这种异常，而干扰HSP70的活性则能加重α-synuclein介导的毒性〔12〕。然而，在转基因啮齿类动物方面的研究却出现有争议的结果。一些研究发现转A53T基因鼠在成年出现黑质－纹状体变性、α-synuclein及泛素阳性包含体形成和运动障碍。然而也有其他的报道称该种模型只有纹状体神经纤维丧失而无黑质多巴胺能神经元变性，也没有黑质包含体形成及运动障碍。这些研究结果的差异可能与实验方法及动物品种不同有关。

α-synuclein突变引起多巴胺能神经元死亡的生化机制可能涉及它对UPS清除的抵抗及蛋白酶体的损坏〔13〕。突变及损伤的蛋白质被认为可以饱和并抑制UPS的活性，导致大量的未能被充分降解的蛋白质在细胞内聚集。野生型α-synuclein可由蛋白酶体降解，但是突变的α-synuclein相对地抵抗蛋白水解。此外，在PC12细胞，突变型的α-synuclein还可抑制UPS的活性，导致不能被充分降解的泛素化蛋白质的进一步聚集、包含体的形成及细胞死亡。同时，表达突变的α-synuclein后，培养的细胞对蛋白酶体抑制剂及氧化应激更加敏感，进一步提示它对UPS活性的干预。事实上，α-synuclein可直接与PA700相互作用，直接抑制蛋白酶体活性。因此，UPS清除突变的αsynuclein的功能衰竭能够解释一部分家族PD病人α-synuclein及其他蛋白质在Lewy小体内的聚集、细胞功能的改变及神经变性。

3 泛素－蛋白酶体系统与散发性帕金森病

逐渐增加的证据提示，蛋白水解应激构成散发PD神经变性及Lewy小体形成的基础。在黑质氧化蛋白质的聚集提示在这一脑区蛋白质的清除是不充分的。也有在黑质蛋白质沉积增加的证据，更提示了蛋白质在该区域的聚集。推测这种蛋白水解应激及蛋白质聚集可能与散发PD黑质26/20S蛋白酶体结构及功能的缺陷有关。

对散发PD患者尸检标本的研究发现，黑质中存在蛋白酶体活性的选择性损害及蛋白酶体亚单位表达的降低〔14〕。事实上，在散发PD患者黑质20S/26S蛋白酶体三种酶活性的每一种都大约有40%被抑制，而皮层及纹状体则没有这种改变。同样，在散发PD黑质多巴胺能神经元内20S蛋白酶体的α亚单位而不是β亚单位显著缺失，而在其他脑区和在年龄匹配的对照组却没有观察到这种现象。α亚单位的丢失可引起26/20S蛋白酶复合体的不稳定性、蛋白酶体装配的缺陷及PA700与20S蛋白酶体结合能力的降低，这些变化均能导致蛋白酶体功能活性的损害。此外，与其他脑区比较，散发PD黑质中PA700的表达水平显著降低，而PA28的表达水平更是非常显著地降低，几乎检测不到。总之，以上研究均提示UPS功能紊乱可能是构成散发PD黑质多巴胺能神经元易感及变性的基础。

4 泛素－蛋白酶体系统与帕金森病模型

如上所述，PD病人确实存在UPS功能的损害。然而，还不知道UPS功能的损害是神经变性的原发性还是继发性因素。

在大鼠应用线粒体复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮，可选择性地诱导黑质－纹状体通路多巴胺能神经变性及富含α-synuclein的胞浆包含体形成，因而可模拟PD的病理特征〔15〕。为了理解UPS和PD发病机制间的关系，在应用鱼藤酮的大鼠检验大脑皮层、纹状体及中脑蛋白酶体的功能，发现腹侧中脑20S蛋白酶体的酶活性显著地和选择性地降低。此外，腹侧中脑中被泛素标记的蛋白质(蛋白质降解的指示剂)的水平也显著增加，这进一步提示26S蛋白酶体降解通路的损害〔16〕。蛋白酶体功能的损害可能由复合体Ⅰ抑制诱导的能量产生障碍(如ATP的产生)引起，或者由复合体Ⅰ抑制诱导的自由基形成增加所致。应用腹侧中脑原代细胞培养的研究提示，鱼藤酮诱导的蛋白酶体功能损害主要由于ATP的耗竭而非自由基的产生。然而，慢性暴露于低水平的鱼藤酮极少引起生物能量变化，但可显著增加氧化应激的水平，提示增加的氧化应激可能对神经元变性起更大的作用。在鱼藤酮处理后观察到氧化损伤蛋白质水平的增加，这可以通过阻碍UPS或者通过直接氧化修饰蛋白酶体自身的亚单位损害蛋白酶体通路。研究显示〔17〕，在SH-SY5Y成神经瘤细胞，鱼藤酮对复合体Ⅰ的抑制通过增加氧化修饰蛋白质产物来降低蛋白酶体的活性，这也包括蛋白酶体自身的氧化修饰。因此，增加的氧化应激可抑制蛋白酶体的功能并最终导致神经元变性。

最新的实验表明，给成年大鼠系统地注射天然的(epoxomicin)或人工合成的(PSI)蛋白酶体抑制剂，经过1～2 w的潜伏期，动物出现进展型的帕金森综合征，表现为运动徐缓、僵直、震颤及姿势异常，经阿朴吗啡治疗上述症状可明显改善〔18〕。正电子发射x线断层摄影证实，C11标记的CFT与纹状体多巴胺能神经末梢的结合降低，提示黑质－纹状体路径的变性。尸检分析显示纹状体多巴胺的损耗及黑质致密部伴有凋亡及炎症的多巴胺能细胞死亡。另外，神经变性也发生在蓝斑、迷走神经背侧运动核及Meynert基底核。在神经变性部位，部分残存的神经元可见胞浆内嗜曙红的、含有α-synuclein/泛素的、类似Lewy小体的包涵体。蛋白酶体抑制剂所诱导的动物模型很好地模拟了PD的病理特征，为研究PD发病机制及药物治疗提供了新的有价值的模型。

5 泛素－蛋白酶体系统与氧化应激

PD与氧化应激及线粒体功能紊乱密切相关。氧化应激状态可来自于:①有高度活性的自由基产物增加;②清除这些活性基团的能力降低;③氧化损伤的蛋白质、脂质及DNA产生的增加，及③对细胞有毒性作用的氧化产物清除的降低。许多细胞过程可以形成自由基，包括线粒体氧化呼吸链及多巴胺代谢。在线粒体电子传递链的某些位点存在电子泄漏。与PD相关的电子泄漏位点存在于电子传递链的复合体Ⅰ内，与鱼藤酮等抑制剂的结合位点极其接近。对线粒体呼吸链来讲，并不需要明显的损害，只要部分抑制便能导致自由基的形成及氧化应激。事实上，大鼠体内及成神经纤维瘤细胞体外实验显示，鱼藤酮处理后的复合体Ⅰ抑制可导致蛋白质羰基水平增加，标志氧化应激的存在〔19，20〕。此外，在PD病人黑质观察到脂质过氧化物及DNA和蛋白质氧化损伤的增加。在PD黑质中也观察到了谷胱甘肽水平的降低，谷胱甘肽是一种自由基清除剂，它的降低进一步提示PD中存在氧化应激。

此外，由于基础状态下多巴胺在自身氧化及代谢过程中可产生自由基，因而多巴胺能神经元对额外增加的氧化应激尤为易感〔21〕。多巴胺有自身氧化并生成多巴胺-醌、超氧化物自由基及过氧化氢的倾向，所有这些物质或者本身就是高度活性分子或者能够快速产生自由基。额外的氧化损伤如环境中线粒体毒素引起的氧化损伤能增加多巴胺能神经元的易感性。

氧化应激可直接或间接地影响UPS。蛋白酶体组分要么直接被氧化〔22〕要么被增加的氧化蛋白产物所抑制，这都可以导致细胞内损伤蛋白质的毒性聚集。多巴胺也能诱导PC12细胞UPS的抑制，这部分依赖于自由基的产生及多巴胺的再摄取〔23〕。此外，PD病人黑质低水平的蛋白酶体激活因子也能使黑质多巴胺能细胞对氧化及水解应激更易感〔24〕。

6 泛素-蛋白酶体系统的抑制、蛋白质的沉积及多巴胺细胞的死亡

理解UPS在PD发病机理中作用的一个方法是看UPS的损害能否复制PD的病理特征，这包括胞浆包含体的形成及选择性的黑质-纹状体通路的破坏。有人〔25〕将蛋白酶体抑制剂注射至纹状体，导致酪氨酸羟化酶及DAT免疫染色的丢失，但是没有明显的GAD67免疫染色的丢失，这提示药物引起纹状体多巴胺终末的选择性丢失。此外，纹状体多巴胺及其代谢物DOPAC的水平是降低的，而5-羟色胺的水平没有变化，证实了UPS抑制对黑质-纹状体多巴胺能通路的选择性毒性作用。纹状体UPS抑制也导致黑质多巴胺能神经元的退行性变及残留黑质神经元内胞浆包涵体的形成。体内及体外实验显示，抑制多巴胺的合成可减轻蛋白酶体抑制剂诱导的毒性，而增加多巴胺可用性的药物则增强蛋白酶体抑制剂诱导的毒性，这提示UPS抑制对多巴胺能神经元及其终末的选择性毒性作用依赖于内源性多巴胺的可用性〔26〕。但是，这并不能解释为什么VTA多巴胺能神经元不受影响。可能的解释是蛋白酶体亚单位在黑质及VTA神经元的差异性表达或者在这两个区域蛋白酶体的功能角色不同。

新近报道，在SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞系，低水平的慢性蛋白酶体抑制可通过增加自由基的产生及降低复合体Ⅰ和复合体Ⅱ的活性显著地改变线粒体的动态平衡〔27〕，这些改变有助于氧化应激。UPS的抑制可复制PD的突出的特征，因而证实了PD发病机制中涉及UPS功能的损害。

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