鸭肝炎病毒现场分离株单克隆抗体的研制

周珍辉，陈万荣，周育森，向双云，曹金元，李玉冰，杨久仙，曹授俊 ，田璐，张浩

（1.北京农业职业学院 畜牧兽医系，北京 102442；2.中国军事医学科学院 微生物流行病研究所，北京 100071）

Ⅰ型鸭病毒性肝炎（serotypeⅠ duck viral hepatitis，DHV Ⅰ ）由Ⅰ型鸭肝炎病毒引起，以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征，临床表现为痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，主要病变为肝脏出血、坏死和肿胀，是危害养鸭业最严重的疾病之一[1-4]。笔者对分离的DHV进行纯化，并制备单克隆抗体，旨在建立特异性强、敏感性高、简便快速的DHV检测方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

毒株由北京某鸭场分离，经动物试验、鸭胚尿囊腔接种、PCR诊断，确诊为Ⅰ型鸭肝炎病毒[5-6]。试验动物BALB/c小鼠由中国军事医学科学院试验动物中心提供；SP2/0骨髓瘤细胞由中国军事医学科学院分子病原研究室提供；抗体亚类试剂盒购自Gibco公司；10日龄鸭胚及1日龄雏鸭购自北京三江宏利牧业有限公司。

1.2 抗原制备及鉴定

1.2.1 DHV抗原的纯化

将临床发病鸭的肝脏制成悬液，通过尿囊腔接种10日龄鸭胚，收集接种后4～5 d死亡的鸭胚尿囊液，反复冻融后，4 ℃ 6 000 r/min离心，去沉淀，取上清，加等量氯仿，振摇20 min，4 ℃ 6 000 r/min离心，去沉淀，取上清，重复上述过程6次，收集上清液。在收集的上清液中加入10% PEG6000及终浓度为0.4 mol/mL的NaCl，4 ℃磁力搅拌过夜后，4℃1 2 000 r/min离心，去上清，沉淀加少量pH7.4、0.01 mol/mL PBS重悬，再经蔗糖密度梯度超速离心纯化[7]。设30%和60% 2个蔗糖梯度，于10 mL离心管中，每一梯度溶液加4 mL，最后在溶液面上加粗提抗原2 mL，经35 000 r/min离心4 h，分别收集各明显的梯度带。纯化抗原作适当稀释，磷钨酸负染，透射电镜观察病毒粒子的形态及纯度。……