大肠埃希菌临床株Dr粘附素的检测及其序列分析

刘世花，刘德梦，赵庆英，宫艳格

（天津医科大学第二医院感染性疾病研究所，天津300211）

大肠埃希菌是临床上最常见的致病菌，致病因素复杂，而粘附素是其主要致病因素之一。其中Afa/Dr家族粘附素是大肠埃希菌的主要粘附素之一，它主要表达于肠道弥漫粘附性大肠埃希菌和尿道致病性大肠埃希菌。而Dr粘附素又是该家族粘附素中的一个重要成员，与30%～50%膀胱炎、50%儿童慢性腹泻、30%孕妇肾盂肾炎及青年女性复发性泌尿系统感染密切相关，携带Dr粘附素的大肠埃希菌有形成慢性和复发性感染的倾向[1]。目前，我国缺乏对Afa/Dr家族粘附素的研究。本实验通过扩增大肠埃希菌该家族粘附素的共有序列afa/draC及Dr粘附素的特异序列draE，从而了解该家族粘附素及Dr粘附素在大肠埃希菌临床株中的携带情况及编码粘附蛋白draE基因的突变情况。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 600株大肠埃希菌分离自天津市某医院患者送检的各种标本，剔除重复菌株，其中261株来自泌尿系感染患者的尿，244株来自急性腹泻患者的便，22株来自呼吸道痰标本，其他73株来自其它部位(外伤分泌物、血、腹水)。

阳性对照菌株AAEC191A(pCC90)由美国华盛顿大学Steve Moseley教授惠赠。阴性对照菌株为国际通用无菌毛代表菌株E.coli K-12p678-54菌株，由英国伯明翰大学儿童保健中心Stuart Knutton教授惠赠。

1.2 主要仪器 PCR扩增仪533244249（德国Eppendorf公司）、thermo-mixer恒温震荡仪（德国Eppendorf公司）、离心机5415D（德国Eppendorf公司）、DYY-6D型电泳仪和水平电泳槽（北京六一仪器厂）、GELDOC-200型凝胶成像系统（美国BIORAD公司）

1.3 主要试剂 Premix（PerfectShotTMTaq）、DNA marker DL 2000购自大连宝生物TaKaRa生物工程公司，引物由上海生物工程公司合成，序列分别为：

两对引物扩增的目的基因分别为Afa/Dr家族粘附素的afa/draC及draE基因片段，长度大小分别为672bp、484bp。

1.4 DNA提取 参照Pitout[2]方法提取细菌总DNA。95℃水浴加热10min，以11000r/min速度离心10min，小心吸取上清液保存，作为PCR模板。

1.5 PCR扩增afa/draC和draE基因 反应体系：50μL，含Premix（PerfectShotTMTaq）25μL，上下游引物各2μL，DNA模板4μL，去离子水17μL。

反应条件：afa/draC：预变性94℃4min，变性94℃45s，退火53℃30s，延伸72℃1min，共30个循环，末次循环延伸72℃8min。

draE:预变性94℃4min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃45s，共30个循环，末次循环延伸72℃8min。

PCR产物分析：取6μL PCR产物，在含0.5mg/L溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶中电泳30min。使用BIO-RAD凝胶成像系统观察结果，分析PCR产物。如果出现特异性扩增条带可能为阳性菌株。

1.6 DNA序列测序及分析 PCR扩增产物送上海英骏生物公司进行正负双向DNA测序。测序结果与genebank中的标准序列进行比对，应用DNAstar软件将draE的DNA测序结果转化为氨基酸序列后与阳性对照株pCC90所对应的氨基酸序列进行比对分析。

2 结果

2.1 Afa/Dr家族粘附素的携带率 600株大肠埃希菌中402株afa/draC基因阳性，阳性率为67.0%。其中分离自尿的大肠埃希菌261株中186株阳性，阳性率71.3%；分离自便的大肠埃希菌244株中169株阳性，阳性率为69.3%；其余47株阳性菌株分别来自痰和其他分泌物。PCR扩增afa/draC基因电泳结果见图1。

图1 大肠埃希菌临床株afa/draC基因片段的PCR扩增产物电泳图Fig1 PCR amplification of afa/draC in E.coli clinical strainsM.DL2000DNA Marker;1.阳性对照;2.100;3、4、5.实验中的阴性菌株;6. B1683;7.阴性对照;8.空白对照

2.2 draE基因的扩增及序列分析 402株携带Afa/Dr家族粘附素的大肠埃希菌3株经PCR检测出现484bp的预期条带，PCR扩增draE基因电泳结果见图2。PCR产物送上海英俊生物公司进行测序。结果与genebank AF329316的基因序列进行比对，发现阳性对照株pCC90的该段基因序列与genebank所示完全一致；3株临床分离株的draE基因序列与阳性对照株pCC90对比具有高度同源性（大于99%），其中分别存在1～3处碱基的缺失或插入，分别在第10、第42、第436、第475位点碱基的缺失及第7～8、第479～480位点之间碱基的插入，其详细突变情况见表1。应用DNAstar软件将上述DNA测序结果转化为氨基酸序列后与阳性对照株pCC90所对应的氨基酸序列进行比对，结果显示同源性均为100%。

图2 大肠埃希菌临床株draE基因片段的PCR扩增产物电泳图Fig.2 PCR amplification of draE in E.coli clinical strains M.DL2000DNA Marker;1.阳性对照;2.100;3.321;4.B1683;5.阴性对照

表1 3个阳性菌株draE基因序列突变位点Tab 1 The mutations of draE in three positive bacterias

2.3 Dr粘附素的携带率 600株大肠埃希菌中3株（0.5%）携带draE基因，占Afa/Dr家族粘附素的0.75%。其中1株分离自泌尿道，另2株分离自消化道急性腹泻患者的粪便。

3 讨论

大肠埃希菌是目前医院感染中最主要的病原菌之一，而抗菌药物的广泛使用使得细菌的耐药日益严重，重症感染者单用敏感抗生素往往不能改善病情进展。随着人们对细菌致病机制的研究，毒力因子将成为抗感染治疗的新靶位[4]。大肠埃希菌的毒力因子主要包括粘附素、毒素、外膜蛋白、铁转运系统等。其中粘附素是借助粘附激活被粘附细胞的信号传导系统，使其不同程度释放不同种类的细胞因子，导致炎性反应性损伤；而某些粘附因子与受体作用，激活细胞凋亡控制系统，引起细胞凋亡。炎症损伤和细胞凋亡有利于细菌生长、繁殖和扩散。

目前发现大肠埃希菌重要粘附素之一Afa/Dr家族粘附素包括13种亚型，基因结构主要由afa/ draA、afa/draB、afa/draC、afa/draD、afa/draE 5个基因片段组成，A～D基因片段具有相对高的保守性，而编码粘附蛋白E基因片段具有高度的变异性。其中C基因编码引导蛋白，与周浆蛋白一起辅助粘附蛋白到达细菌表面；E基因编码粘附蛋白，二者是细菌粘附于细胞的关键结构，C基因和E基因的某些突变可以使引导蛋白或粘附蛋白的结构和功能发生改变。

本研究通过Afa/Dr家族粘附素共有序列afa/ draC及Dr粘附素的特异序列draE基因PCR检测、序列分析，对600株大肠埃希菌临床株该家族粘附素及Dr粘附素的携带率进行了分析。研究结果显示，402株携带Afa/Dr家族粘附素，阳性率为67.0%；其中分离自泌尿道、消化道的大肠埃希菌afa/draC基因阳性率分别为71.3%、69.3%，说明Afa/Dr家族粘附素是泌尿道感染、急性腹泻相关大肠埃希菌的一个主要的粘附素。在402株携带Afa/Dr家族粘附素的大肠埃希菌中，3株携带Dr粘附素，占家族粘附素的0.75%。2007年美国学者Natalia[5]对美国华盛顿某医院的大肠埃希菌Dr粘附素的检测发现其占家族粘附素的25%，远远高于本实验结果，这可能是由于地区差异和实验菌株的来源不同导致的，国外研究的实验菌株主要分离自复发性尿路感染和慢性肾盂肾炎患者，而本实验菌株主要分离自膀胱炎及急性腹泻患者。以往的研究显示Dr粘附素在尿道致病性大肠埃希菌中检出率最高，DraE阳性的大肠埃希菌结合于分化完全的膀胱上皮细胞，而本研究中3株draE阳性的大肠埃希菌仅有1株分离自泌尿系统，另2株都分离自消化道，其具体作用机制及这3株菌是否具有同源性有待进一步研究。

在泌尿系感染和腹泻的发生过程中，Dr粘附素与Ⅳ型胶原的识别起到关键作用，而draE基因编码粘附蛋白通过周浆伴侣途径分泌至细菌表面[6]，是细菌粘附于细胞的关键结构。点特异性突变实验表明，DraE的第54个氨基酸必需带有负电荷才有氯霉素敏感的受体结合特点，氨基酸序列在第32、40、54、90和113位点上突变会改变粘附素的粘附能力和氯霉素敏感特性，使得Dr粘附素不能与Ⅳ型胶原结合[7]。本实验draE基因阳性的3株大肠埃希菌，PCR扩增后进行测序，与genebank比对显示：与阳性对照株pCC90对比具有高度同源性，所测菌株均存在1～3个点突变，进行氨基酸比对显示与阳性对照株pCC90的同源性均为100%。说明本实验检测出的阳性菌株在致病过程中Dr粘附素起着很重要的作用。

总之，Dr粘附素在尿道致病性大肠埃希菌和腹泻相关性大肠埃希菌的致病过程中具有重要作用。目前粘附素及其受体的结构研究仍是国内外研究的热点，本实验为进一步研究Dr粘附素提供基础，笔者可以进一步对DraE蛋白进行克隆表达研制相应的疫苗，从而使粘附素成为抗感染治疗的新靶位，降低大肠埃希菌的致病作用。

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［2］ Pitout J,Thmoson K,Hanson N,et al.Plasmid-mediated resistance to expanded-spectrum cephalosporins among enterobacter aerogenes strains[J].Antimicrob Agent Chemother,1998,42(3):596

［3］ Jouve M,Garcia MI,Courcoux P,et al.Adhesion to and invasion of HeLa cells by pathogenic Escherichia coli carrying the afa-3gene cluster are mediated bythe AfaE and AfaDproteins,respectively[J]. Infect Immun,1997,65(10):4082

［4］ Clatworthy AE,Pierson E,Hung DT.Targeting virulence:a new paradigmforantimicrobialtherapy[J].NatChemBiol,2007,3(9):541

［5］ Natalia K.Selection for functional diversity drives accumulation of point mutations in Dr adhesins of Escherichia coli[J].Mol Microbiol,2007,64(1):180

［6］ Servin AL.Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev,2005,18(2):264

［7］ CarnoyC,MoseleySL.Mutational analysis ofreceptor bindingmediated bythe Dr familyofEscherichia coli adhesins[J].Mol Microbiol, 1997,23(2):365