核桃仁醇提物抑制癌细胞生长相关蛋白表达的作用 *

司 高

(郑州外国语学校,河南郑州 450001)

笔者既往研究发现,核桃仁醇提物对癌细胞生长具有明显抑制作用[1]。为了探讨核桃仁醇提物对癌细胞作用的分子机制,本实验观察了核桃仁醇提物对癌细胞生长相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人骨肉瘤细胞株Hosp36、乳腺癌细胞株MCF-7、人卵巢癌细胞株SKOV3和人肺腺癌细胞株A549均购于中国医学科学院基础研究所细胞中心。

1.2 药品、试剂与仪器

核桃(Juglans regia L.)购自郑州土产商店。取其仁50 g,加入无水乙醇250 mL浸泡1周;滤纸过滤,用旋转蒸发仪58℃浓缩药液;真空干燥,获得棕黄色油状的核桃仁醇提物;用二甲基亚砜(DMSO)溶解为 300 g/L的贮存液,-20℃冰箱保存备用。实验时用不含血清培养基配成所需浓度,以0.22μm滤膜过滤,加入血清后使用。RPMI 1640和MEM培养基,Gibco公司产品;胎牛血清,Gibco公司产品;苯甲基磺酰氟(PMSF)和亮抑制肽(Leupeptin),Am resco公司产品;丙烯酰胺,Biomol公司产品;胰蛋白酶与辣根过氧化物酶偶合的山羊抗小鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP,华美公司产品;增强化学发光(enhanced chemiluminecence,ECL)试剂盒,Santa Cruz公司产品;磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)单克隆抗体,韩国浦项科技大学国家信号传导网络实验室惠赠;表皮生长因子受体(epithelialgrowth factor receptor,EGFR)单克隆抗体,Santa Cruz公司产品;蛋白激酶Cα(PKCα)多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)、蛋白分子量标准,均由中国科学院上海生物化学研究所提供;考马斯亮蓝G250,Am resco公司产品;硝酸纤维素膜,Life Science公司产品;其他化学试剂均为分析纯,商业购得。Heraeus细胞培养箱,德国Kendro公司产品; Axiovert 25倒置显微镜,Zeiss公司产品;BioMate紫外分光光度计,Thermo公司产品;SG-603生物安全柜,Bake公司产品;pH测定仪,意大利HANNA公司产品;可调移液器 P1000、P200、P100、P20,均为Gilson公司产品;12通道加样器,Thermo公司产品;蛋白电泳系统,Bio-Rad公司产品;ChemiDoc XRS成像分析系统,BIO-RAD公司产品;ROTINA 35型离心机,德国Hettich公司产品;3-18K型台式高速冷冻离心机,Sigma公司产品;RE-3000B旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂产品;DZF-6050真空干燥箱和DK-S24型电热恒温水浴锅,上海精宏试验设备有限公司产品;自动消毒锅,TOMY公司产品;超纯水制备仪,LABCONCO公司产品;78-1型磁力加热搅拌器,江苏姜堰市天力医疗器械有限公司产品; VCX750超声破细胞破碎仪,Sonics＆Materials公司产品。

1.3 细胞培养

从液氮罐中取出癌细胞株,水浴解冻;吸出细胞悬液移入15 mL离心管中;加入10 mL无血清培养基,混匀;1 000转/min离心10min,弃上清,将细胞接种于含 10%胎牛血清的培养液中,Hosp36和MCF-7细胞用MEM培养基,SKOV3和A549细胞用RPMI1640培养基;于37℃、5%CO2培养箱中培养,每间隔 48 h更换 1次培养基;待细胞生长至70%汇合率时,用胰蛋白酶溶液(用D-Hans液配制,含0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸二钠, pH值为8.3)消化,按实验要求接种于96孔培养板中或 Φ100培养皿中。

1.4 检测指标

采用免疫印迹法[2]测定细胞中EGFR、PLC-γ1、 PKCα蛋白含量。将细胞接种在 Φ100培养皿中,在37℃、5%CO2培养箱内培养24 h;分别按IC50药物浓度加入药物,抑制骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌细胞生长的IC50值分别为108.050,216.654,254.153, 593.244mg/L;培养48 h,收获细胞,用细胞裂解液(由20mM HEPES、pH值为7.2,10%甘油,50 mM NaCl,1%TritonX-100,1 mM Na3VO4,10mg/L Leupeptin和1mM PMSF组成)裂解;14 000 g、4℃离心15min,收集上清,用Bradford法测定蛋白浓度, 20μg/孔上样,经8%十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳(8%SDS-PAGE);分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉TTBS溶液(由10 mM Tris、pH值为7.6,150 mM NaCl,0.05%Tween-20组成)封闭滤膜1 h;每张膜用所要检测蛋白相应的抗体室温反应4～6 h;用TTBS洗涤30m in;用相应的羊抗鼠或羊抗兔IgG-HRP反应2 h,用TTBS洗涤30min;将膜转入另一塑料袋中,加入ECL试剂A、B液,封口;将硝酸纤维素膜放于暗盒中,放上 X光胶片曝光,显影,定影,洗片。

2 结 果

与对照组相比,以核桃仁醇提物处理过的细胞的蛋白显影条带减弱,说明核桃仁能下调癌细胞EGFR、PLC-γ1和PKCα蛋白表达水平,其作用强弱依次为骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌和肺癌。见图 1。

图1 核桃仁醇提物对4种癌细胞EGFR、PLC-γ1和PKCα蛋白表达的影响

3 讨 论

生长因子与细胞膜上相应的受体结合向细胞核传递生长信号引起细胞正常生长,异常增强的细胞生长信号是癌细胞失控生长的关键原因。抑制癌细胞生长的信号传递是抗癌药物研制的重要途径。本研究观察了核桃仁醇提物是否能够通过抑制EGFR生长信号传递来抑制癌细胞生长。EGFR生长信号传递过程是EGFR→PLC-γ1→PKCα→细胞生长。EGFR是跨细胞膜受体,分子量为170 kDa;PLC-γ1是细胞膜内侧蛋白,分子量为145 kDa;PKCα是胞浆蛋白,分子量为80 kDa。各种原因引起EGFR、PLC-γ1、PKCα过量表达或EGFR细胞内部分的酪氨酸磷酸化而高度激活,均会依次使PLC-γ1、PKCα磷酸化,而这些都会使癌细胞失控生长。免疫印迹方法是根据抗体与抗原特异性结合的原理,先将蛋白通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离开来,然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,再用已知抗体与膜上蛋白反应,结合上的抗体再与辣根过氧化物酶偶联的抗免疫球蛋白抗体反应,最后加入酶联抗体生色底物或发光底物,在膜上抗原抗体结合处显示染色蛋白条带,或用 X光片曝光,在胶片上出现蛋白显影条带,根据条带的有无、位置和深浅可以鉴定细胞或组织样品中是否有相应蛋白的表达、分子量的大小及表达量的多少。本实验采用免疫印迹方法检测核桃仁醇提物对癌细胞中EGFR、PLC-γ1、PKCα表达的作用,发现核桃仁醇提物能明显抑制癌细胞中EGFR、PLC-γ1、PKCα表达水平,说明核桃仁醇提物抑制癌细胞EGFR→PLC-γ1→PKCα的生长信号传导是其抑制癌细胞生长的重要机制。

核桃仁历来被视为营养保健的安全果品,具有补肾温肺润肠[3-4]、抗氧化[5]和增强免疫作用[6]。本研究发现核桃仁醇提物确有抑制癌细胞生长的作用,并揭示出它抑制癌细胞生长的一种重要分子机制。

[1]司高.核桃仁醇提物抑制癌细胞生长的实验观察[J].中医研究,2011,24(1):26-29.

[2]J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M].2版.北京:科学出版社,1992:880-897

[3]雷载权.中药学[M].上海:上海科学技术出版社,1995: 297.

[4]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,2009:2182.

[5]汤昆.核桃仁抗氧化活性成分对自由基DPPH清除时间和清除率的研究[J].中成药,2009,31(8):1287-1288.

[6]盛强.核桃仁水提液对免疫功能低下模型小鼠免疫功能的影响[J].中国中医药科技,2006,13(4):242-243.