血红素加氧酶-1重组乳酸乳球菌灌胃对正常大鼠肠黏膜屏障的影响

高新跃 任从才 韩京军

血红素加氧酶-1(HO-1)，是HO家族中最重要的酶，为诱导型酶［1］。生理状态下，消化道中的HO同工酶主要为HO-2，而HO-1在肠组织中不表达，只有在缺血缺氧等刺激下才开始分泌HO-1［2，3］。本实验室已经证明，利用基因工程原理合成HO-1重组乳酸乳球菌，对正常大鼠灌胃后能够到达回肠组织，原位分泌大量重组HO-1，对失血性休克和/或内毒素血症大鼠，有较好的肠黏膜屏障保护效应，明显减少肠道炎症反应的发生程度［4-9］。同时也证明，HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃，单纯增加灌胃剂量和次数不能有效增加回肠

HO-1的表达，反而可能使回肠HO-1的表达降低［10］。本实验在上述实验的基础上，进一步研究HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃后，是否影响肠黏膜屏障功能?

1 资料与方法

1.1 药品和试剂 HO-1重组乳酸乳球菌，本实验室构建合成。磷酸盐缓冲液(PBS)，湖北省武汉博士德生物试剂有限公司出品;乳酸乳球菌素(Nisin)，美国Sigma公司出品;髓过氧化物酶(MPO)活性试剂盒，江苏省南京建成生物试剂公司出品，其余试剂为市售。

1.2 动物分组 健康、清洁级标准的雄性SD大鼠40只，体重在280～320 g之间，由江苏省徐州医学院实验动物中心提供。根据数字随机表法分为5组:HO-1重组乳酸乳球菌灌胃1次组(HO1t组，n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃2次组(HO2t组，n=8)、HO-1重组乳酸乳球菌灌胃三次组(HO3t组，n=8)、PBS溶液灌胃1次组(PBS1t组，n=8)和乳酸乳球菌灌胃1次组(LL1t组，n=8)。各组灌胃剂量的容积均为1 ml，每次灌胃间隔24 h。所有动物均在实验前适应饲养环境7 d，自由饮食，单独饲养。饲养环境和实验室环境温度保持在22℃ ～25℃之间。

1.3 灌胃剂量 将Nisin诱导表达3 h的HO-1重组乳酸乳球菌，离心(8000 g，5min)收获菌液，PBS洗3次(10000 g，1 min)弃上清后，再加入适量的PBS使菌液浓缩10倍(活菌数达5×109CFU/ml)，用1 m l的细菌悬浮液作为一次灌胃的剂量。在同样条件下培养未转染的乳酸乳球菌NZ9000，取1 ml的细菌悬浮液作为一次灌胃的剂量。PBS溶液灌胃一次组，用1 ml PBS溶液做为灌胃剂量。

1.4 组织标本的收集 于末次灌胃后24 h，使用过量水合氯醛麻醉动物，无菌条件下打开胸腹腔，从大鼠的右心室抽取2 ml-3 ml的血液注入血培养瓶中。另距回肠末端取下5 cm长度的一段回肠，其中1 cm用10%甲醛溶液浸泡，余下的回肠立即保存在-80℃冰箱内。

1.5 检测指标

1.5.1 组织学检查 光镜(100倍)下观察肠黏膜形态，采用Chiu’s 6级评分法评价肠黏膜损伤程度:0分为正常;1分为绒毛顶端上皮下间隙增大;2分为上皮层和固有层中度分离;3分为绒毛两侧有大量分离伴有部分绒毛顶端破损;4分为绒毛破损伴有固有层毛细血管大量暴露;5分为固有层破坏、出血及溃疡。

1.5.2 肠组织MPO活性 采用比色法测量肠组织内的MPO活性，MPO活性大小主要反映组织内的中性粒细胞(PMN)数量，具体操作按照说明书进行。

1.5.3 细菌移位 将抽取的1 ml血液立即注入血培养瓶中，利用 BACTEC9120全自动血培养仪和 Bacton Dickinson Bactec 9000软件发现有细菌生长的血培养瓶，然后再利用生物梅里埃APR鉴定系统鉴定细菌种类。

1.6 统计学方法 对于定量数据，采用均数±标准差，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析;使用SPSS 13.0英文版统计软件进行统计分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学检查 各组肠黏膜Chiu's评分比较无统计学意义，提示各灌胃组对肠道无损害作用。

2.2 肠组织MPO活性的比较 如表1所示:与LL1t组比较，HO2t组和PBS1t组的肠组织内MPO活性较高，但差异无统计学意义(P＞0.05);与LL1t组比较，HO1t组和HO3t组的MPO活性无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05);说明各灌胃组对肠道组织MPO的影响相似。

表 1 HO1t组、HO2t组、HO3t组、PBS1t组和LL1t组组肠组织MPO活性结果(x±s，MPO活力单位/克湿片)

2.3 细菌移位 HO1t组、PBS1t组和LL1t组血培养阴性，HO2t组有1例、HO3t组有2例血液细菌培养阳性，移位的细菌按出现次数依次为:大肠杆菌、木糖葡萄球菌、类白喉棒状菌等。

3 讨论

肠道功能的改变，首先表现为肠黏膜形态的变化，出现黏膜水肿和绒毛断裂，发生肠黏膜屏障功能减退。通过Chiu's评分可以判断出肠黏膜受损情况，是反映其功能改变的形态学指标［11］。

在失血性休克期，肠道内的正常菌群依赖肠道内的营养物质大量繁殖，细菌和(或)其释放的内毒素通过受损的肠黏膜屏障转移到肠道外，这个过程称之为细菌移位。细菌移位导致的炎症介质释放，明显比肠道因缺血缺氧刺激引起的炎症介质释放要多［12］。炎症介质通过激活各种信号通路如激活NF-kB信号通路，导致肠道炎症反应引起肠黏膜屏障功能的改变，甚者引起全身炎症反应综合(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)［13］。

PMN作为人体主要的免疫细胞，发挥重要的免疫防御功能，担负着吞噬消灭外来细菌、病毒及其他微生物的使命。正常情况下，肠道内皮细胞通过细胞间连接和粘附功能，形成有效的肠黏膜屏障，使机体免于外界伤害因素的损害。而在病理情况下，大量活化的PMN通过伪足的机械作用和释放各种氧化物质(ROS)，造成肠黏膜屏障受损，发生肠黏膜水肿和肠黏膜屏障功能减退，这是肠道炎症反应发生的重要机制。而机体则分泌具有保护性机制的酶类［14］，如HO-1。HO-1的保护作用包括:抗炎症反应、抗凋亡、抗纤维化［15］，其保护机制与HO-1降解血红素的代谢产物CO、胆绿素、胆红素、铁蛋白相关。

另外一些研究发现，细胞中HO-1的保护作用是有阈值的。HO-1适量表达，可以减少蛋白质氧化、脂质过氧化及细胞死亡;表达量过高时，则会促进乳酸脱氢酶的释放和降低谷胱甘肽转移酶含量，破坏细胞膜的完整性［16］。

本实验室采用的乳酸菌表达系统是一种目前国际上高度通用、食品级的NICE系统(Nisin Controlled Expression system)，被广泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表达［17］，这种食品级微生物能在肠道内存活2～3 d，其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应［10］。通过外源性的补充肠道内的乳酸乳球菌，可以将它携带的克隆基因带到肠道内，发挥药理作用。

本研究条件下，各组Chiu's评分和MPO的差异无统计学意义，说明肠黏膜屏障功能没有发生明显变化。HO2t组和HO3t组发生细菌移位，这可能与大量乳酸乳球菌在肠道内形成的酸胁迫有关［18］，从而对局部细胞的生理功能产生影响，包括破坏细胞膜，抑制多种酶和转运系统的活性等［19］，但这种细菌移位的发生后果以及可能导致的并发症，本研究没有深入值得探讨。因此，在如何提高乳酸工程菌体内分泌重组HO-1的含量，同时不改变胃肠道微环境、破坏肠黏膜屏障等方面需要进一步研究，使乳酸工程菌的基因治疗达到一个理想的效果。

4 结论

本研究条件下，HO-1重组乳酸乳球菌对正常大鼠灌胃，不会随着灌胃次数增加而影响肠黏膜屏障的功能。

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