盐角草总黄酮提取工艺优化

赵梦丹，王仁雷，周 峰，周泉澄，周红霞，华 春,*，李建玲

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046；2.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171；3.江苏教育学院生物系，江苏 南京 210013)

盐角草总黄酮提取工艺优化

赵梦丹1,2，王仁雷3，周 峰2，周泉澄2，周红霞2，华 春2,*，李建玲1

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046；2.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171；3.江苏教育学院生物系，江苏 南京 210013)

采用分光光度法，以芦丁为标准品测定盐角草中的总黄酮含量。通过单因素试验分析乙醇体积分数、固液比、回流时间及回流温度4个主要因素对盐角草中总黄酮提取率的影响。在单因素试验的基础上通过正交设计法优化盐角草总黄酮提取工艺条件。结果表明：盐角草总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数80%、固液比1∶50、回流温度70℃、提取时间4h。此条件下盐角草的总黄酮得率25.172mg/g。实验结果可能为今后盐角草资源的开发利用提供重要的理论依据。

盐角草；总黄酮；热回流提取；正交试验

盐角草(Salicornia europae a L.)，隶属藜科(Chenopodiaceae)盐角草属(Salicornia L.)。盐角草可在含盐分3%以上的盐碱滩涂生长，是地球上最耐盐的陆生高等植物种之一，在江苏省滩涂及盐碱地广泛分布[1]。盐角草的嫩枝和嫩茎鲜美多汁，是欧洲居民传统的时蔬之一。种子含油量达到30%，其中不饱和脂肪酸含量十分丰富，亚油酸含量占70%左右，是一种优良的盐土油料作物。盐角草具有一定的药用价值，其嫩尖组织中的微量皂角甙，对于降低血管壁上胆固醇的活性具有明显作用[2-4]具有降压、降脂、减肥作用。天然黄酮作为生物活性化合物，具有预防和治疗高血压及动脉硬化、抗肝脏毒、抗炎、抗氧化、抗菌及抗病毒、泻下作用等[5-8]，已被作为甜味剂、抗氧化剂、天然色素在医药、化妆品及食品工业中被广泛应用[9-13]。

目前，国内外对盐角草的研究多为对其耐盐机理的研究，对盐角草中黄酮成分及提取工艺研究未见报道。本实验通过对江苏盐城滩涂盐角草植株中总黄酮提取研究，探讨最佳提取工艺，为开发利用天然保健海水蔬菜盐角草提一定参考，为实施江苏沿海开发国家战略中有效开发利用盐碱滩涂奠定基础[14]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

盐角草2010年9月采于江苏盐城滩涂，为藜科(Chenopodiaceae)盐角草属(Salicornia L.)盐角草(Salicornia europaea L.)。

芦丁标准品；石油醚、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LAC164型电子分析天平(精确至0.0001g) 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；DHG-9141A型电热恒温干燥箱上海精宏试验设备有限公司；回流提取装置；索氏提取装置。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取3 7℃烘箱干燥的盐角草地上绿色部分粉末50g，过40目筛，置500mL锥形瓶中，加100mL石油醚脱脂、脱色2h，重复几次，至石油醚层几乎无色，倾去浸提液，样品置于通风处干燥备用。

1.2.2 标准曲线制备

1.2.2.1 芦丁标准溶液

精确称取芦丁标准品0.0213g，置100mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，稀释至刻度，精确量取25mL，置50mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含芦丁0.1065mg的标准溶液。

1.2.2.2 标准曲线制作

精确吸取标准溶液0.0、2.5、7.5、10.0、12.5mL，分别置于5个25mL容量瓶中，加30%乙醇补足至12.5mL。再加入5%亚硝酸溶液0.75mL，摇匀，放置5min。精确加入10%硝酸铝溶液0.75mL，摇匀，放置5min。再精确加入1mol/L的氢氧化钠溶液10mL，用30%的乙醇溶液定容。放置15min，在波长510nm测定吸光度，得到标准曲线的回归方程A=13.1574C-0.009，r=0.9998。

1.2.3 样品总黄酮含量的测定

精密量取样品黄酮提取液10mL，置25mL容量瓶中，加入30%乙醇溶液2.5mL。再加入5%亚硝酸溶液0.75mL，摇匀，放置5min。精确加入10%硝酸铝溶液0.75mL，摇匀，放置5min。再精确加入1mol/L氢氧化钠溶液10mL，用30%的乙醇溶液定容。放置15min，在波长510nm作测定吸光度。根据标准曲线计算提取液中的黄酮含量。总黄酮得率为1g原料中总黄酮的质量(mg)。

式中：Y为总黄酮得率；C为由标准曲线计算得出的待测试液的总黄酮质量浓度/(mg/mL)；V为待测试液的体积/mL；D为待测试液的稀释倍数；m为盐角草粉末质量/g。

1.2.4 精密度实验

精密吸取芦丁对照品溶液5mL(0.1065mg/mL)，按1.2.3节处理，重复测定6次，RSD为0.77%。

1.2.5 稳定性实验

精密吸取芦丁对照品溶液5mL(0.1065mg/mL)，盐角草黄酮提取液10mL，按1.2.3节处理，每5min测定1次吸光度，共测定6次，结果表明显色后在30min内基本无变化，RSD为0.139%。

1.2.6 回收率测定

精密吸取10mL盐角草黄酮提取液6份，分别置25mL容量瓶中，加入芦丁对照品4mL(0.1065mg/mL)，按1.2.3节处理，平均回收率为99.7%，RSD为0.02%。

2 结果与分析

2.1 不同固液比对提取效果的影响

固液比(g/mL)为变量(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)，精密称取1.2.1节处理的盐角草地上绿色部分粉末2g，然后放入150mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇，在80℃水浴回流4h。后用滤纸过滤，滤液待用。按1.2.3节法测定总黄酮含量。

图1 固液比对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由图1可见，溶剂用量对黄酮得率的影响明显，随提取溶剂的增加而先上升后下降。固液比与总黄酮得率的关系显著(P＜0.05)。其中固液比为1∶40时总黄酮得率最高，为23.68mg/g，与其他因素水平差异显著，因此，固液比为1∶40时为最佳固液比。

2.2 乙醇体积分数对提取效果的影响

乙醇体积分数为变量(60%、70%、80%、95%)，按固液比1∶40加入乙醇，其余操作同2.1节。

由图2可见，乙醇体积分数对黄酮得率的影响明显，随乙醇体积分数的增加而先上升后下降。乙醇体积分数与总黄酮得率的关系极显著(P＜0.01)，其中乙醇体积分数80%时总黄酮得率最高，为21.38mg/g，与其他因素水平差异极显著(P＜0.01)。当乙醇体积分数超过80%后，总黄酮得率开始下降，因此，确定乙醇体积分数在80%较好。

图2 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.3 不同回流时间对提取效果的影响

回流时间为变量(2、3、4、5、6h)，固液比为1∶40，乙醇体积分数为80%，其余操作同2.1节。

图3 回流时间对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoid

由图3可见，回流时间对总黄酮得率的影响不是太明显，但还是可以看出随着回流时间的增长而呈先增加后下降的变化规律。回流时间2、3h与总黄酮得率的关系极显著(P＜0.01)，与4、5、6h水平差异不显著(P＞0.05)。其中回流时间为3h时总黄酮得率最高，为23.44mg/g。因此，采用的最佳回流时间为3h。

2.4 不同回流温度对提取效果的影响

回流温度为变量(60、70、80、90℃)，固液比为1∶40，乙醇体积分数80%，回流时间为3h，其余操作同2.1节。

图4 提取温度对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoid

由图4可见，提取温度对黄酮得率的影响明显，随温度的升高而先上升后下降。提取温度与总黄酮得率的关系极显著(P＜0.01)，其中提取温度为80℃时总黄酮得率最高，为23.82mg/g。当提取温度超过80℃后，总黄酮得率开始下降，因此，确定提取温度为80℃。

2.5 正交试验

选取回流温度、回流时间、固液比和乙醇体积分数进行4因素3水平正交试验。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表2 盐角草总黄酮提取工艺优化L9(34)正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

从表2极值可知，各因素影响的主次顺序为乙醇体积分数＞固液比＞回流温度＞回流时间。提取盐角草总黄酮的最佳工艺为A1B3C2D2，即选用回流温度70℃、回流时间6h、固液比1∶50、乙醇80%。从节约能源的角度考虑，回流时间宜采用4h。按A1B2C2D2组合进行3次平行实验，总黄酮得率为25.172mg/g，说明所选取的工艺确为最佳工艺。

3 讨 论

3.1 通过单因素和L9(34)正交试验确定提取的最佳工艺条件：选用80%乙醇、回流温度70℃、固液比1∶50、回流时间4h。总黄酮得率为25.172mg/g。验证实验结果表明该提取工艺具有稳定性好，操作简便，生产成本较低的优点，为进一步开发盐角草黄酮资源提供了参考。

3.2 本实验用石油醚除脂、除色素，以乙醇为提取剂[15]，采用了分光光度法[16]，用芦丁作标准品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系统作显色剂[17]，在波长510nm处测定吸光度，所得标准曲线线性良好，回归方程为A＝13.1574C-0.009，r＝0.9998；显色稳定性在0.5h内良好，RSD为0.139%；精密度实验RSD为0.77%；加样回收率99.7%，RSD为0.02%。

3.3 随着提取分离技术的发展，目前总黄酮的提取方法主要为回流提取法、超声法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法和超临界CO2萃取法。从安全性和实用性考虑，回流提取法仍然非常有优势。它方法简便、设备要求低、成本低廉，最重要的是更易于实现大规模生产应用。

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Process Optimization for Extraction of Total Flavonoids from Salicornia europaea L.

ZHAO Meng-dan1,2，WANG Ren-lei3，ZHOU Feng2，ZHOU Quan-cheng2，ZHOU Hong-xia2，HUA Chun2,*，LI Jian-ling1
(1. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 211171, China；3. Biology Department, Jiangsu Institute of Education, Nanjing 210013, China)

In this study, one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize the conditions for hot reflux extraction of total flavonoids from the shoot of Salicornia europaea L. The determination of total flavonoids was spectrometrically carried out using rutin as the reference standard. The optimal conditions for extracting total flavonoids from the shoot of Salicornia europaea L. were 80% ethanol as the extraction solvent, solid/liquid ratio 1∶50, extraction temperature 70℃, and extraction time 4 h, resulting in a total flavonoid yield of 25.172 mg/g.

Salicornia europaea L.；total flavonoids；hot reflux extraction；orthogonal test

O623.54

A

1002-6630(2011)16-0085-04

2011-04-02

江苏省高校自然科学基础研究面上项目(KJD180118)；江苏省植物生理学精品课程建设项目(2010)；江苏省现代教育技术研究重点课题(2010)

赵梦丹(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为植物资源开发与利用。E-mail：zhaomengdan915@hotmail.com

*通信作者：华春(1963—)，女，教授，硕士，研究方向为植物生理学。E-mail：hc3501988@163.com